[发明专利]一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法

权利要求书

1.一种用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，其特征在于，包括根尖牙乳头干细胞（SCAPs）和富血小板纤维蛋白（PRF），其操作步骤如下：

1）SCAPs的分离、培养，在无菌条件下，取出生一周内的SD乳鼠牙槽骨部分，用无菌磷酸盐缓冲液PBS洗去血污，用镊子拔出第三磨牙牙根，无菌剪刀剪取牙齿根部的根尖牙乳头组织；用枪头将剪下的牙乳头组织转移到含有Ⅰ、Ⅱ型混合胶原酶的离心管中并剪碎；置于37℃细胞培养箱中消化30 min；轻轻吹打消化后的组织，吸取一滴酶液在显微镜下观察，直至肉眼可见细胞团块掉落；加入DMEM/HIGH完全培养基终止消化，然后按1200 r/min的离心频率离心3 min；吸取上清后加入3 ml DMEM完全培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，然后接种于6 cm细胞培养皿备用；

2）SCAPs的免疫荧光法鉴定，荧光显微镜下观察拍照，检测CD24呈阳性即为根尖牙乳头干细胞；

3）PRF的制备，采用动脉抽血液10ml，置于无菌采血管中；立即将试管进行离心；静置后，管内出现3层，由底层到上层分别为红细胞层、白色凝胶状PRF层、血清层，用无菌镊子夹取中间的PRF层备用；

4）SCAPs/PRF复合体的构建及植入，无菌条件下将PRF制备成2mm*3mm大小后置于24孔板内用DMEM培养基预湿，紫外线消毒45min；调整细胞浓度至6*10⁷/ml，每块接种20µl，每块PRF上约有1.2*10⁶个细胞，加1ml培养液进行孵育培养，培养至第3天时植入骨缺损区，于3周和6周后收取牙槽骨组织样本。

2.根据权利要求1所述的用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，其特征是：所述步骤1）中DMEM/HIGH完全培养基是往10 %的FBS种加入100 U/ml 青霉素和100 μg/ml链霉素的双抗。

3.根据权利要求1所述的用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，其特征是：所述步骤2）SCAPs的免疫荧光法鉴定是先将细胞铺板于96孔板，达80%融合后，更换为成骨诱导培养基，设立对照组和成骨诱导组，每3-4天换液1次；采用4%多聚甲醛固定孔板内各组细胞；其次先以PBS清洗3遍，每次5 min；在0.1% Triton X-100的条件下室温通透10 min；再以PBS清洗3遍，每次5 min；5 %FBS封闭，37℃，1h；加入一抗，在4℃条件下孵育过夜；然后以PBS清洗3遍，每次5 min；CY3标记的二抗，在37℃条件下孵育1h；最后以PBS漂洗3次，5min/次，室温避光条件下孵育Hoechst 10min。

4.根据权利要求3所述的用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，其特征是：所述一抗根据抗体说明书进行稀释。

5.根据权利要求1所述的用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，其特征是：所述步骤3）中试管离心15min，离心频率为3000r/min。

6.根据权利要求1所述的用于牙槽骨缺损修复的组织工程化材料制备方法，其特征是：所述步骤4）孵育培养温度为37℃、饱和湿度为50ml/LCO₂条件下隔日换液，每日在显微镜下观察并培养。