[发明专利]一种SNP分子标记、PCR引物及应用

说明书

本发明提供了一种SNP分子标记、PCR引物及应用，涉及分子标记及其应用技术领域。所述SNP分子标记包括位于rpoB基因上的SNP1～SNP 8和位于gyrB基因上的SNP 9～SNP 15。本发明提供的SNP分子标记在9种分枝杆菌中具有多态性，通过检测分枝杆菌在SNP位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种SNP分子标记、PCR引物及应用。

背景技术

由结核分枝杆菌复合群引起的结核病(Tuberculosis，TB)是单一致死率最高的传染性疾病。2020年WHO报告提示，TB感染者20亿，占全球总人数1/3-1/4，而发病人数约1000万例，死亡人数140万例。相应地，我国TB感染者约3.5亿，发病人数为86.6万，死亡3.9万，居世界第三位。

结核分枝杆菌复合群隶属分枝杆菌(Mycobacterium)属，主要包括结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和肯尼迪分枝杆菌等几个种。在分枝杆菌属内，除结核分枝杆菌复合群和麻风分枝杆菌外，还包括鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌等100多个种，他们也称为非结核分枝杆菌(No-tuberculosis mycobacteria，NTM)。

传统鉴别分枝杆菌的方法是根据菌落形态、氧偏好性、烟酸积累、硝酸盐还原酶的活性等表型特征判断，方法简单、试剂价格便宜，易于推广而被沿用至今。但其耗时长、阳性率低、污染大且缺乏可重复性，不能准确、及时地为临床诊断提供参考。随着分子生物学技术的迅速发展，基于PCR等技术，利用分枝杆菌属内同源DNA序列的特异性可以完成结核分枝杆菌菌种与分枝杆菌属内其他菌种的鉴定或鉴别，从而为临床诊断和治疗提供了客观依据，同时由于快速、高效、特异性高等优点而倍受青睐。

全基因组测序技术伴随分子生物学技术的快速进步而日臻完善，已成为鉴定菌种的“主流技术”。其依据不同种分枝杆菌的DNA同源性片段序列的特异性将该分枝杆菌鉴定至种或亚种水平，更进一步极大地提高了分辨力和准确性，同时鉴定时间明显缩短。但是由于其价格昂贵，大多用于科研，很难适用于临床诊断。

16SrDNA是细菌DNA序列，可编码染色体上16SrRNA相对应的序列，是所有细菌染色体基因的固有序列，可用于菌种鉴定。其种类少，含量大，分子大小适中，既能体现不同菌属间的差异，又可通过测序技术较容易测出其序列，作为鉴定分枝杆菌的“金标准”能够将细菌鉴定至种水平。但由于某些分枝杆菌同源DNA序列一致性高、亲缘性接近，16SrDNA序列组成完全一致，从而无法区分一些亲缘关系较近的菌株，比如鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌、龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌、堪萨斯和胃分枝杆菌等。因此目前急需研发一种改进的准确性高、快速鉴别分枝杆菌的方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种SNP分子标记、PCR引物及应用。本发明提供的SNP分子标记在9种分枝杆菌中具有多态性，通过检测分枝杆菌在SNP位点上的碱基类型即可鉴别出待测的分枝杆菌的种类。

本发明提供的技术方案如下：

在第一方面，本发明提供了一种用于鉴定结核分枝杆菌复合群的SNP分子标记，所述SNP分子标记包括位于rpoB基因上的SNP1～SNP 8和位于gyrB基因上的SNP 9～SNP 15；其中，

SNP1位于SEQ ID No.1所示序列5’端起14位，碱基是A、G；

SNP2位于SEQ ID No.1所示序列5’端起26位，碱基是C、G；

SNP3位于SEQ ID No.1所示序列5’端起65位，碱基是C、T；

SNP4位于SEQ ID No.1所示序列5’端起128位，碱基是C、G；