[发明专利]一种紫薇原生质体的制备方法

说明书

本发明涉及植物原生质体技术领域，具体涉及一种紫薇原生质体的制备方法。本发明针对紫薇提供原生质体的制备方法，该方法以紫薇叶片为材料，将紫薇叶片去除下表皮，将去除下表皮的叶片在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体。该方法能够高效地从紫薇叶片中提取获得原生质体，制备的原生质体具有较高的完整性和活性，为紫薇的分子育种提供了基础。

技术领域

本发明涉及植物原生质体技术领域，具体涉及一种紫薇原生质体的制备方法。

背景技术

原生质体是指去除细胞壁后，由质膜包围的具有生活力的植物细胞。原生质体易于制备，且分离提纯后可以在合适的条件下生存数天，仍具有活细胞的一切特征，并具有一定的繁殖能力。由于没有细胞壁，原生质体可以摄入包括细胞核、细胞器基因组或外源DNA片段等遗传物质，是一种非常好的瞬时表达系统，也是研究基础生命科学及作物育种改良的理想实验材料。目前大量物种均已分离出原生质体，分布于40余科，160余属中，主要为茄科、豆科、禾本科、菊科和蔷薇科，但这些物种间原生质体分离的条件各不相同，物种之间的差异性较大。

紫薇(Lagerstroemia indica)作为夏季开花的木本植物，具有花期长、花量大、抗逆性强等优良品质，且近年来也培育了很多株型各异的新品种，因此紫薇是园林应用中重要的资源，但由于其木本植物的属性，在分子育种方面受到很大的限制，尤其是遗传转化体系建立困难，无法获得转基因植株。鉴于原生质体在分子育种方面的优良性质，在紫薇中分离原生质体是对其后续分子研究及培育新品种的重要基础。

目前未见从紫薇中成功分离出原生质体的现有技术，开发高效的紫薇原生质体的制备方法对于紫薇的分子育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种紫薇叶肉原生质体的制备方法。本发明的另一目的是提供用于紫薇原生质体制备的酶解液及其应用。

本发明以紫薇叶片为材料制备紫薇叶肉原生质体，针对紫薇的种属特点以及叶片的结构等特点，开发一种针对紫薇叶片材料的原生质体制备方法。由于不同植物的细胞结构等存在较大差异，采用其他植物的原生质体分离方法进行紫薇叶片的处理，较难得到较高的原生质体数量，且得到的原生质体的完整性和活性也不佳。因此，需要针对紫薇叶片开发其特异性的原生质体制备方法。本发明在研发过程中发现，与其他处理植物叶片的方法(如切丝等)相比，将紫薇叶片的下表皮去除得到叶肉，对叶肉进行酶解处理并分离原生质体的方法能够显著提高分离得到的原生质体的数量，同时有利于保证原生质体的完整性和活性。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种紫薇叶肉原生质体的制备方法，该方法包括：将紫薇叶片去除下表皮，将去除下表皮的叶片在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体。

具体地，紫薇叶片的处理方法为：将新鲜的紫薇叶片轻微失水萎蔫，然后将上表皮固定，撕去下表皮，得到去除下表皮的叶片。

优选地，将新鲜的紫薇叶片放置在25℃的遮光气候箱内处理20-30min，使叶片轻微失水萎蔫。

上述叶片轻微失水萎蔫以叶片开始变软失水但未出现边缘卷曲为标准。

上述方法中，上表皮的固定可采用胶带固定。

本发明中，所述紫薇叶片优选为紫薇开展幼嫩叶片。更优选为轻微遮光处理的紫薇幼嫩开展叶片，一般为当年枝条修剪后萌发出的幼嫩枝条上的叶片。

以上所述的方法中，所述酶解液包括质量比为1：(0.5-0.6)：(0.3-0.4)的纤维素酶、离析酶和果胶酶。与使用其他酶及其组合相比，采用上述配比的纤维素酶、离析酶和果胶酶能够显著提高紫薇叶肉的酶解效率，进而提高原生质体的数量。