[发明专利]一种紫薇原生质体的制备方法有效
| 申请号： | 202111108086.6 | 申请日： | 2021-09-22 |
| 公开（公告）号： | CN113652390B | 公开（公告）日： | 2023-08-11 |
| 发明（设计）人： | 潘会堂;刘洁茹;池秀凤;冯露;程堂仁;王佳;张启翔 | 申请（专利权）人： | 北京林业大学 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04;C12N9/42;C12N9/18;C12N9/26;C12N9/88 |
| 代理公司： | 北京路浩知识产权代理有限公司 11002 | 代理人： | 商秀玲 |
| 地址： | 100083 北京市*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 紫薇 原生 质体 制备 方法 | ||
1.一种紫薇原生质体的制备方法，其特征在于，包括：将新鲜的紫薇叶片轻微失水萎蔫后，将上表皮固定，撕去下表皮，得到去除下表皮的叶片，将去除下表皮的叶片在酶解液中酶解处理，得到酶解溶液，将所述酶解溶液经分离得到叶肉酶解产物，经洗涤后分离得到叶肉原生质体；
所述酶解液由如下组分组成：纤维素酶1%、离析酶0.5%、果胶酶0.4%、甘露醇0.6M、KCl15-25mM、pH为5.5-5.8的MES 15-25mM、CaCl2 5-15mM、BSA 0.05-0.15%和DTT 3-6mM；
所述酶解的条件为：在25±2℃的黑暗条件下酶解5-6h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫薇叶片为紫薇开展幼嫩叶片。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将放入去除下表皮的叶片的酶解液遮光抽真空25-35min，再置于25±2℃的黑暗条件下酶解。
4.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，将所述酶解溶液过65-75μm的筛网得到所述酶解产物。
5.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述酶解产物中加入W5溶液洗涤1-3次；
所述W5溶液包括如下组分：NaCl 150-160mM、CaCl2 120-130mM、KCl 3-7mM和pH为5.5-5.8的MES 1-3mM。
6.根据权利要求1~3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述洗涤采用离心的方法分离，所述离心的转速为500-700rpm，时间为4-6min。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将洗涤后的原生质体重悬于悬浮液中，所述悬浮液包括如下组分：0.6M甘露醇、4mM MgCl2和4mM MES。
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