[发明专利]一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用

说明书

本发明公开了一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及应用，属于生物技术领域。该工程菌株在基因组上整合了β‑香树脂醇合酶表达模块、11/30位‑氧化‑β‑香树脂醇酶表达模块、细胞P450氧化酶表达模块和细胞色素P450还原酶表达模块；其构建步骤为：构建得到甘草次酸生物合成模块质粒：β‑香树脂醇合成酶bAS，细胞色素P450氧化酶88D6CYP88D6，11位/30位‑氧化‑β‑香树脂醇酶CYP725A4，细胞色素P450还原酶CPR，将甘草次酸生物合成模块整合至解脂耶氏酵母工具质粒上，将整合了甘草次酸生物合成模块的质粒线性化后导入解脂耶氏酵母中，得到基因组上整合了甘草次酸生物合成模块的解脂耶氏酵母工程菌。本发明的工程菌株生产甘草次酸产量显著提高，最高达到7g/L。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用。

背景技术

甘草是一味补气类中药,是临床上应用最为广泛的中药。甘草味甘、性平，入心、脾、肺、胃经，具有补脾益气、润肺止咳、清热解毒、缓解止痛、缓和药性等作用，甘草次酸和甘草酸为甘草中的主要药用成分，其中甘草次酸是甘草酸生物合成的前体物，具有与甘草酸相似的药理生理学活性。研究表明，甘草次酸具有免疫调节、抗过敏、抗病毒感染的作用，对致癌性的病毒如肝炎病毒，EB病毒及艾滋病毒的感染均有抑制作用。由于其广泛的药用价值和经济价值，使甘草次酸的生产备受企业追捧。目前甘草次酸的合成方法主要是通过溶剂萃取法，其通过将甘草进行提取、分离、沉淀、干燥等诸多步骤得到甘草酸粉，再经提取结晶得到甘草次酸，其合成步骤多、路线长、成本高且收率低、纯度低，并不利于甘草次酸的工业生产，同时操作过程中需使用危险试剂，严重危害人体安全。也有利用酿酒酵母为宿主菌，使用合成生物学的方法生产甘草次酸，但都停留在以甘草酸为前体合成甘草次酸的阶段。

本发明提供了一种生物合成甘草次酸的操作方法，确切的说提供了一种以解脂耶氏酵母使用葡萄糖为底物从头生产甘草次酸的方法，该方法具有高效、快速、节能、环保、健康等诸多优势，且符合国家绿色碳环保的政策需求，是绿色可持续发展的重要路径。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一株以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株构建方法以及应用，该工程菌株用于以葡萄糖为底物高产甘草次酸，甘草次酸产量高、纯度高。

一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：构建得到甘草次酸生物合成表达模块质粒：β-香树脂醇合成酶bAS表达模块质粒，细胞色素P450氧化酶88D6CYP88D6表达模块质粒，11位/30位-氧化-β-香树脂醇酶CYP725A4表达模块质粒，细胞色素P450还原酶CPR表达模块质粒，将甘草次酸生物合成模块整合至解脂耶氏酵母工具质粒上，将整合了甘草次酸生物合成模块的质粒线性化后导入解脂耶氏酵母中，得到基因组上整合了甘草次酸生物合成模块的解脂耶氏酵母工程菌。

按上述方案，采用重组方式敲除解脂耶氏酵母基因组的羊毛甾醇合酶(ERG7)位点，在该位点整合表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)，以将代谢流导向至2，3-氧化角鲨烯。

按上述方案，上述方案还包括对解脂耶氏酵母基因组进行如下重组改造：通过过表达截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)和羟甲基戊二酸合成酶(HMGS)，增强MVA代谢途径的流向。所述截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)的截短范围为蛋白质N端前300-500个氨基酸序列，更优选的截短范围为蛋白质N端前450-500个氨基酸范围，最优选的截短序列为蛋白质N端前500个氨基酸序列。

按上述方案，上述方案还包括在解脂耶氏酵母菌株上整合细胞色素b5。

按上述方案，所述的细胞色素b5基因序列如SEQ ID NO.9所示，来源于灰色锥虫。

按上述方案，所述的解脂耶氏酵母工具质粒为单拷贝整合质粒或多拷贝整合质粒。