[发明专利]一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用

权利要求书

1.一种生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：解脂耶氏酵母工程菌基因组中整合了bAS，CYP88D6，CYP725A4，CPR基因，具有以葡萄糖为底物，从β-香树脂醇，经11位-β-香树脂醇、30位羟基-11位氧化香树脂醇合成甘草次酸的能力。

2.根据权利要求1所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上敲除羊毛甾醇合酶(ERG7)位点，在该位点整合表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)。

3.根据权利要求1或2所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上过表达截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)和羟甲基戊二酸合成酶(HMGS)；其中截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)的截短范围为蛋白质N端前300-500个氨基酸序列，更优选的截短范围为蛋白质N端前450-500个氨基酸范围，最优选的截短序列为蛋白质N端前500个氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上整合有细胞色素b5。

5.根据权利要求4所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的细胞色素b5基因序列如SEQ ID NO.9所示，来源于灰色锥虫。

6.权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：构建得到甘草次酸生物合成表达模块质粒：β-香树脂醇合成酶bAS表达模块质粒，细胞色素P450氧化酶88D6CYP88D6表达模块质粒，11位/30位-氧化-β-香树脂醇酶CYP725A4表达模块质粒，细胞色素P450还原酶CPR表达模块质粒，将甘草次酸生物合成模块整合至解脂耶氏酵母工具质粒上，将整合了甘草次酸生物合成模块的质粒线性化后导入解脂耶氏酵母中，得到基因组上整合了甘草次酸生物合成模块的解脂耶氏酵母工程菌。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：结合改造目的，采用重组方式敲除解脂耶氏酵母基因组的羊毛甾醇合酶(ERG7)位点，在该位点整合表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)，以将代谢流导向至2，3-氧化角鲨烯；

和/或对解脂耶氏酵母基因组进行如下重组改造：通过过表达截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)和羟甲基戊二酸合成酶(HMGS)，增强MVA代谢途径的流向；其中截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)的截短范围为蛋白质N端前300-500个氨基酸序列，更优选的截短范围为蛋白质N端前450-500个氨基酸范围，最优选的截短序列为蛋白质N端前500个氨基酸序列；

和/或在解脂耶氏酵母菌株上整合细胞色素b5。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工具质粒为单拷贝整合质粒或多拷贝整合质粒，所述的单拷贝整合质粒为pINA1269质粒；多拷贝整合质粒为pINA1292。

9.权利要求1-5任一所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株在以葡萄糖为底物合成甘草次酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的应用方法为：

将生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株培养，获得种子液；

将种子液接种到含有葡萄糖和解脂耶氏酵母生长必需金属元素和营养物质的发酵培养基中，分批补料发酵，发酵过程中pH控制范围为5.6-6.4；分批补料葡萄糖控制其浓度在20-40g/L。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的发酵温度为28-32℃；发酵时间优选为120h-150h。