[发明专利]靶向小鼠BBS５基因的gRNA及构建Bardet–Biedl小鼠模型的方法

说明书

本发明属分子生物学领域，具体公开了一组靶向小鼠BBS５基因的gRNA及构建Bardet–Biedl小鼠模型的方法；本发明设计了特异性靶向BBS5基因的gRNA，利用cas9将BBS5基因的第3个外显子到第7个外显子敲除，造成移码突变，从而达到将该基因敲除的目的。该方法简单易行，周期短，在小鼠受精卵内就可实施，获得阳性克隆的几率很高。由该方法获得的BBS５基因敲除小鼠是作为研究BBS综合征的最佳模型，利用该小鼠模型可以充分研究该疾病的致病机理，并进一步开发针对该疾病的治疗方式。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体公开了能够有效敲除小鼠BBS5基因的gRNA 序列及其应用。

背景技术

巴迪特-比德尔综合征（Bardet–Biedl Syndrome,BBS）是一种遗传性疾病，影响身体的许多部位。患有这种综合症的人由于视锥、视杆营养不良导致的渐进性视力障碍；额外的手指或脚趾；肥胖症;男性性腺功能下降：肾脏异常;和学习困难等异常表型。通常开始于儿童发育期，早期存在夜盲问题，然后是周围视力盲点的发展，最终发展成隧道视觉。大多数人还会导致青春期或成年早期失明，身体异常包括多指（后轴多面体）肾脏问题（多囊肾）肥胖症,以及额外的生殖器异常和不孕不育,学习障碍等。目前已经知道这种疾病是隐性遗传的，许多基因的突变会导致巴迪特-比德尔综合征。目前已经发现有12个BBS基因，针对该疾病无有效的治疗方式。BBS5基因编码了与BBS综合征相关的蛋白质，细胞内的实验表明，这种基因在细胞中表达，是形成纤毛结构所需的蛋白。BBSome复合物被认为是将特定囊泡膜蛋白分拣到纤毛膜发育所需。Rab8 （GTP）进入原生纤毛，促进纤毛膜的延伸。实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。为了研究该疾病的发病机理以及开发有效治疗方式，构建该疾病的小鼠模型对于该疾病的研究不可或缺，目前还缺乏有效的构建Bardet–Biedl小鼠模型的方法。

发明内容

针对现有技术不足，本发明设计了简单有效的方式，能利用Crispr/Cas9系统快速在小鼠体内将BBS5基因敲除，构建该疾病的模型。 Crispr/Cas9技术能够在gRNA 的指引下在精准切割DNA造成双链断裂，在DNA双链修复时将突变引入基因组DNA中（见附图１）。同时在两个gRNA的指引下，基因组中的大片段DNA能够被切除。Cas/sgRNA复合物行使功能需要PAM序列，不同Cas酶，其对应的PAM并不完全相同。gRNA通常包括：靶标结合区和Cas蛋白识别区。靶标结合区与Cas蛋白识别区通常以5’到3’的方向连接。靶标结合区的长度通常为15～25个碱基，更通常为18～22个碱基，如20个碱基。靶标结合区与DNA的模板链特异性结合，从而将Cas9招募到预定位点。通常，DNA模板链上gRNA结合区域的对侧区紧邻PAM，或者隔开数个碱基(例如10个以内，或8个以内，或5个以内)。

本发明包括以下技术方案：

一组靶向小鼠BBS５基因的gRNA，包括两条gRNA，其核酸序列分别为：

gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- ACTCTTACTATCCTATCCACTGG-3’；

gRNA2= SEQ ID NO 2= 5’ - TTCAATCCCCATGACGCTCATGG-3’。

进一步的，一种靶向小鼠BBS５基因的基因敲除试剂盒，所述试剂盒中包括如上述一组gRNA。

进一步的，使用上述靶向小鼠BBS５基因的gRNA构建Bardet–Biedl 综合症小鼠模型的方法，所述方法包括利用gRNA1和gRNA2将小鼠BBS５基因敲除。

进一步的，使用上述靶向小鼠BBS５基因的gRNA构建Bardet–Biedl 综合症小鼠模型的方法，所述gRNA1和gRNA2分别靶向BBS５基因第３个外显子的５＇端和第７个外显子的３＇端。