[发明专利]靶向小鼠BBS５基因的gRNA及构建Bardet–Biedl小鼠模型的方法

权利要求书

1.一组靶向小鼠BBS５基因的gRNA，其特征在于，包括两条gRNA，其核酸序列分别为：

gRNA1=SEQ ID NO 1=5’- ACTCTTACTATCCTATCCACTGG-3’；

gRNA2= SEQ ID NO 2= 5’ -TTCAATCCCCATGACGCTCATGG-3’。

2.一种靶向小鼠BBS５基因的基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如权利要求1中的一组靶向小鼠BBS５基因的gRNA。

3.使用如权利要求1所述的一组靶向小鼠BBS５基因的gRNA构建Bardet–Biedl 综合症小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括利用gRNA1和gRNA2将小鼠BBS５基因敲除。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA1和gRNA2分别靶向BBS５基因第３个外显子的５＇端和第７个外显子的３＇端。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述gRNA1和gRNA2将BBS５基因第３～第７个外显子之间的６０９２ｂｐ的DNA切除，切除后的基因在转录形成的mRNA第２个外显子与第８个外显子剪切时融合，翻译蛋白质时形成移码突变。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将上述两条gRNA与Cas9蛋白共注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0小鼠；

2）提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序，鉴定是否为嵌合体；3）待雄性Founder小鼠到8周龄，雌性小鼠到6周龄，分别与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠，小鼠出生14天后PCR鉴定，若有阳性小鼠出生，则表示基因敲除成功。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的测序引物为：

PCR测序引物=SEQ ID NO 3=5’-GCCTTCATTGCTCTAGTGTTAGGA-3。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：

PCR Primers1，其序列分别为：

F1=SEQ ID NO 4=5’-AGAGCCAGATACGGTAGTGCATGCT-3’

R1= SEQ ID NO 5=5’-GCCTTCATTGCTCTAGTGTTAGGA-3’。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中PCR鉴定中的引物包括：

PCR Primers2，其序列分别为：

F1=SEQ ID NO 4=5’-AGAGCCAGATACGGTAGTGCATGCT-3’

R2=SEQ ID NO 6=5’-ACAAGAGCCAGAGGTCCTGGG-3’。

10.如权利要求3-8任一项所述的方法构建获得的Bardet–Biedl 综合症模型小鼠。