[发明专利]一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。本发明的引物探针组合能够准确的对SARS‑CoV、MERS‑CoV和SARS‑CoV‑2病毒进行检测。且本发明方案提供的试剂盒能同步检测3种冠状病毒，特异性、稳定性和重复性良好。表明该方法对于实现可视化、高通量、平行化检测，及结果快速、准确，阅读方便性能稳定。

技术领域

本发明属于体外基因检测技术领域，具体涉及一种检测冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及方法。

背景技术

SARS-CoV与SARS-CoV-2(COVID-19)分别引起传染性非典型肺炎和严重急性呼吸综合征两种不同传染病。两种病毒均属于β属B亚群冠状病毒，形态上多以椭圆形或球形的单链RNA病毒，且其具体基因结构有明显差异。根据现有研究结果表明SARS-CoV与SARS-CoV-2两种病毒的氨基酸同源性仅为76％左右，但都通过细胞受体血管紧张素转化酶II(ACE2)对宿主细胞进行入侵。因此推测两种病毒可能具有类似的致病机理。除此之外，其余四种人源冠状病毒分别为人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)和人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)，仅能引起轻微上呼吸道症状，故受到关注度较为有限。MERS-CoV是一种β属C亚群冠状病毒，全名中东呼吸综合征冠状病毒，引发中东呼吸综合征导致严重的呼吸系统相关疾病。虽然对于新发传染病开展的各项研究工作十分重要，可以给疫苗设计以及药物靶点带来十分重要的证据参考，但对于这类新发传染病诊断方法的研究同样重要。

目前对SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2的检测方法主要基于核酸检测法为主。核酸检测法是针对病毒RNA基因序列中的保守序列设计引物进行检测，包括基因测序(Singer测序)、荧光定量PCR、微滴式数字PCR(ddPCR)、基因芯片和环介导等温扩增(LAMP)等检测技术。但是相关技术表明，基因测序技术具有高敏感性、高准确性的优势，但是仪器成本较高，依赖专业人士对序列的解读分析，且检测时间较长，目前还未适用于大规模检测。荧光定量PCR具有优异的灵敏度和特异性，但也存在仪器昂贵，需要专业人士对结果进行分析，检测成本较高等不足。微滴式数字PCR技术具有绝对定量和高灵敏度的优势，由于这些优势大大降低了假阴性风险，提高检测的准确性。但该技术依赖于昂贵的仪器，成本较高，因此较难大规模普及。环介导等温扩增技术虽然灵敏度高、不需要特殊仪器，但实验过程中由于开盖造成的气溶胶污染，以及部分实验室功能分区不明确等，导致假阳性问题影响结果判断；并且该方法对引物设计要求较高，从而限制某些靶基因不适宜此法。基因芯片通过不同探针阵列、使用特定分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值。目前基于基因芯片使用固相主要为聚合物基片(尼龙膜，硝酸纤维膜、玻片等)，在其表面对核酸探针或cDNA片段进行固化，再使用经由同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测成像。该方法具有所需检测设备与目前分子生物学采用基于放射显影技术相同。但其不足为同位素标记检测需要专用仪器进行读数，且读数结果也依赖专业人员进行处理分析，且对冠状病毒的检测效果不好。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测冠状病毒的引物探针组合。

本发明还提出一种上述引物探针组合在制备基因芯片中的应用。

本发明还提出一种上述引物探针组合在制备冠状病毒检测的试剂盒中的应用。

本发明还提出一种检测冠状病毒的试剂盒。

本发明还提出一种检测冠状病毒的方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种检测冠状病毒的引物探针组合，所述引物探针组合，包括：