[发明专利]BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及多聚体构建技术领域，具体公开了BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用，通过设计并合成串联多聚体引物BmSPI38‑Nde I‑BamH I‑F、BmSPI38‑Not I‑R、BmSPI38‑Bgl II‑R和BmSPI38‑L‑Bgl II‑R，以BmSPI38‑p28为模板扩增获得目的基因片段，利用同尾酶法设计并构建了BmSPI38同型串联多聚体载体，再通过转化、诱导表达、纯化获得BmSPI38同型串联多聚体。本发明获得的BmSPI38同型串联多聚体能够成功抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K的活性，且活性更强，表达形式更为均一。

技术领域

本发明涉及多聚体构建技术领域，具体涉及BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用。

背景技术

家蚕(又称桑蚕)是一种绢丝昆虫，属鳞翅目蚕蛾科，具有非常高的经济价值。研究发现，昆虫体内的免疫过程缺乏淋巴细胞及免疫球蛋白的参与，病原微生物在入侵其宿主的过程中会分泌大量的胞外蛋白酶，这些胞外蛋白酶可作为毒力因子来辅助病原微生物对昆虫的入侵过程。为了抵御病原微生物的入侵，宿主生物在一般情况下都会表达高水平的蛋白酶抑制剂，以抵抗病原微生物所分泌的胞外蛋白酶。因此丝氨酸蛋白酶抑制剂在昆虫的免疫系统中占据非常重要的作用。

从家蚕中共鉴定到了80种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，SPI)，其中包括11种SPI结构域的蛋白酶抑制剂，即Serpin、Kunitz、BPTI、Kazal、TIL等。BmSPI38属于TIL类蛋白酶抑制剂，可通过抑制球孢白僵菌分泌的体壁降解蛋白酶CDEP-1来防止真菌菌丝穿透家蚕体壁，因此可作为家蚕真菌抗性因子发挥重要的免疫功能。但是研究发现BmSPI38单体形式无抑制活性，且发现BmSPI38多聚体形式虽然具有对枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶K的抑制活性，但是目前多聚体化对蛋白酶抑制剂自身活性的影响尚不完全清楚。且发现，现有技术中的BmSPI38多聚体活性低、均一性差。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用，利用同尾酶法设计并构建了BmSPI38同型串联多聚体的表达载体，再通过转化、诱导表达、纯化获得BmSPI38同型串联多聚体，能够成功抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K的活性，且活性更强，表达形式更为均一。

本发明的第一个目的是提供BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法，具体包括如下步骤：

S1，设计并合成串联多聚体引物BmSPI38-Nde I-BamH I-F、BmSPI38-Not I-R、BmSPI38-Bgl II-R和BmSPI38-L-Bgl II-R，以BmSPI38-p28为模板扩增获得目的基因片段，回收目的片段后与T载体连接，然后转入感受态细胞，培养后筛选阳性克隆，分别记为，NdeⅠ/BamHⅠ-SPI38-NotⅠ、Nde I/BamH I-SPI38-BglⅡ、Nde I/BamH I-SPI38L-BglⅡ；

所述引物BmSPI38-Nde I-BamH I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物BmSPI38-Not I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物BmSPI38-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述引物BmSPI38-L-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2，利用Nde I和Not I双酶切，将Nde I/BamH I-SPI38-Not I从T载体上切下，连接到p28载体上，成功构建BmSPI38单体的表达载体BmSPI38-monomer；

S3，同尾酶法(BamH I与BglⅡ互为同尾酶)设计并构建了BmSPI38同型串联多聚体的表达载体；