[发明专利]BmSPI38的同型串联多聚体及其构建方法和应用

权利要求书

1.BmSPI38的同型串联多聚体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1，设计并合成串联多聚体引物BmSPI38-Nde I-BamH I-F、BmSPI38-Not I-R、BmSPI38-Bgl II-R和BmSPI38-L-Bgl II-R，以BmSPI38-p28为模板扩增获得目的基因片段，回收目的片段后与T载体连接，然后转入感受态细胞，培养后筛选阳性克隆，分别记为，NdeI/BamH I-SPI38-Not I、NdeI/BamHI-SPI38-Bgl Ⅱ、NdeI/BamHI-SPI38L-Bgl Ⅱ；

所述引物BmSPI38-Nde I-BamH I-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述引物BmSPI38-Not I-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述引物BmSPI38-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述引物BmSPI38-L-Bgl II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

S2，利用Nde I和Not I双酶切，将Nde I/BamH I-SPI38-Not I从T载体上切下，连接到p28载体上，成功构建BmSPI38单体的表达载体BmSPI38-monomer；

S3，同尾酶法设计并构建了BmSPI38同型串联多聚体的表达载体；

所述BmSPI38同型串联多聚体的表达载体为：

不加Linker的BmSPI38二聚体载体BmSPI38-dimer，加Linker的BmSPI38二聚体载体BmSPI38-L-dimer，不加Linker的BmSPI38三聚体载体BmSPI38-trimer，加Linker的BmSPI38三聚体载体BmSPI38-L-trimer，不加Linker的BmSPI38四聚体载体BmSPI38-tetramer，加Linker的BmSPI38四聚体载体BmSPI38-L-tetramer；

S4，将获得的BmSPI38单体的表达载体和BmSPI38同型串联多聚体的表达载体转入大肠杆菌中，并利用IPTG对其进行诱导表达，然后通过离心收集菌体，超声破碎菌体细胞，离心获得表达有BmSPI38单体蛋白和BmSPI38同型串联多聚体蛋白的菌体上清，然后进行蛋白纯化，所述蛋白纯化方式为镍柱亲和层析纯化，用400mM咪唑洗脱；

相比于BmSPI38单体，BmSPI38串联多聚体对蛋白酶的抑制活性能力强，均一性好。