[发明专利]一种利用低共熔溶剂裂解细胞并直接用于聚合酶链式扩增反应的方法

说明书

本发明公开了一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液，其特征在于，包括如下步骤：首先制备低共熔溶剂，然后将微量生物检材加入到低共熔溶剂中，在50℃‑60℃温度中孵育，并且震荡10‑20分钟后，取微量低共熔溶剂直接加入PCR扩增体系中，低共熔溶剂的量不超过扩增总体积的30％，检材与离子液体的质量比为1:99‑1:50。本发明利用低共熔溶剂裂解细胞提取DNA方法，低共熔溶剂制备方法具有操作简单、耗时短、成本低、提取效率高的特点，扩宽低共熔溶剂应用领域，以微量或痕量的生物样本的裂解物即能进行PCR检测，一定条件下与磁珠试剂裂解纯化法相当或略优。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液。

背景技术

DNA作为生物体重要的遗传信息物质，其检测和分析已广泛应用于各个领域，尤以应用最为广泛的聚合酶链式扩增反应(PCR)在临床疾病诊断、食品安全、环境治理、动物疫病，特别是在法庭鉴定中已经成为一种不可或缺的技术手段。

刑事侦查领域的生物样品具有其特殊性，现场采集到的样品经常是微量、甚至是痕量。虽然理论上一个DNA模板就可完成PCR反应，但实际工作中需要一定量的DNA模板数和良好的质量才可完成PCR过程。特别是法庭鉴定过程中经常使用STR分型技术，受DNA模板数和质量的影响较大，如果模板量不足会造成基因座丢失或峰值过低而无法保证鉴定的准确性。目前，PCR进行之前需要对生物样品中的DNA进行提取纯化处理，主要方法包括Chelex-100法、有机法(饱和酚法)、二氧化硅法(硅珠法、磁珠法)、盐析法等，虽然各有优势，但对于微量甚至痕量生物样品中的DNA来说不甚满意，因为这些方法中都需要多步操作，包括裂解、吸附、漂洗、最后洗脱得到较干净的DNA，在这些操作过程中难免丢失一些DNA，最终难以满足PCR的模板要求。因此，近年来裂解液直接PCR扩增技术逐渐受到重视，因为不需要繁杂的操作过程，避免了微量生物样品中DNA的丢失，特别适合于微量或痕量生物样品，尤以接触性样品为佳，例如指纹中的DNA。至今，已有一些专利涉及此技术，例如，中国专利(CN105441421 A)“一种细胞裂解方法”，其主要功能成分为蛋白酶K，主要适合于培养的细胞悬液的裂解。中国专利(CN 102177250 A)“由粗制核酸样品直接扩增的方法”，其使用的细胞裂解成分为氢氧化钠，该方法产生的粗制核酸样品只能适合于该专利中特定的PCR直接缓冲液，该缓冲液中含有一定量的非离子表面活性剂、甘油和牛血清白蛋白(BSA)。而这些化合物在常规市售的PCR缓冲液中并不含有，因此可能影响氢氧化钠裂解后的粗制核酸样品在常规市售PCR缓冲液中的扩增。有鉴于此，迫切需要新的具有良好细胞降解能力和DNA提取能力的溶剂，同时对下游PCR过程无影响。

低共熔溶剂(Deep eutectic solvent，DES)作为一种新型绿色溶剂，由于具有原料来源价廉丰富、合成简单以及产物无需提纯等优点，与其他分离技术相结合被广泛用于蛋白质和核酸的纯化，这类和离子液体有很多相似之处的新型溶剂比离子液体更环保、具有可降解性，因此引起了越来越多人的关注。一种低共熔溶剂可以简单地通过Lewis酸和碱混合、或者氢键供体(hydrogen bond donor)和氢键受体(hydrogen bond acceptor)的混合而制备。最重要的是该溶剂的性质是可以根据需要可调的。制备得到的低共熔溶剂熔点低于其组成化合物，在室温条件下以液态存在，即使组成化合物在室温时是固态。咪唑是一种五元芳杂环化合物，其分子结构中含有两个间位氮原子。咪唑具有酸性，也具有碱性，在pH6的环境中，其3位的N原子质子化，使得咪唑环带有正电荷，当在pH6的条件下又去质子化，形成不带电的咪唑环，可以利用其与DNA的结合能力作为DNA的输送载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种直接用于聚合酶链式扩增反应的细胞裂解液，其特征在于，包括如下步骤：