[发明专利]一种ɑ-芋螺毒素MI-蛋白偶联抗原及其应用

说明书

本发明公开了一种ɑ‑芋螺毒素MI抗原制备及其免疫血清或抗体的应用。所述α‑芋螺毒素MI由14个氨基酸组成。本发明MI‑牛血清蛋白偶联抗原是通过点击反应制备的，MI的含炔基多肽与叠氮乙酸修饰BSA载体蛋白点击反应形成MI‑偶合载体蛋白抗原。该蛋白载体偶联抗原的抗原表位不受影响，免疫原性高，免疫Balb/c小鼠及马后，MI包被的ELISA显示鼠抗血清、马抗血清抗体滴度高。MI抗血清、抗体与MI共孵育的中和活性实验以及给予MI后再注射抗血清的解毒活性实验显示，制备的MI抗血清、抗体具有很高的中和活性及解毒活性。采用本发明制备的MI‑蛋白偶联抗原可用于抗血清或抗体的制备或筛选，抗血清或抗体用于对ɑ‑芋螺毒素MI及类似物的解毒及检测。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及ɑ-芋螺毒素MI抗原制备及其免疫血清或抗体的应用。更具体来说涉及ɑ-芋螺毒素MI-牛血清蛋白偶联抗原的制备方法以及该抗原免疫动物后制备的抗血清或抗体对MI的解毒及检测应用。

背景技术

α-芋螺毒素MI来自幻芋螺(Conus magus)，其氨基酸序列为GRCCHPACGKNYSC-NH₂，含两对二硫键，连接方式为Cys3-Cys8，Cys4-Cys14[Gray W R et al.J Biol Chem.1983,258(20):12247-12251]。MI作用于肌肉型烟碱乙酰胆碱受体，对小鼠的半数致死剂量约15-20μg/kg(腹腔注射)[Cruz L J et al.Arch Biochem Biophys.1978,190(2):539-548；Kapono C A et al.Toxicon.2013,70:170-178],为目前发现的毒性最强的芋螺毒素，活性较另一种α-芋螺毒素GI(其氨基酸序列为ECCNPACGRHYSC-NH₂)高[Stiles B G etal.Toxicon.1992,30(4):367-377]。MI、GI等可导致中毒对象肌肉瘫痪及麻木，呼吸困难，心肌损害，心搏停止及至死亡，已有致渔民死亡报道[Anderson P D et al.J BioterrorBiodef.2012,3(03),1–4]。由于其毒性高、分子量小、易合成，有用于人为施毒的可能。

目前MI中毒无有效药物治疗，也未见MI的有效抗毒血清报道，仅见结构相似的α-芋螺毒素GI抗血清[Stiles B G et al.Toxicon.1992,30(4):367-377]及单克隆抗体报道。采用戊二醛法偶联GI至蛋白载体(如牛血清蛋白，孔蓝蛋白或卵清蛋白等)制备全抗原，免疫小鼠、山羊或家兔获得抗血清[唐艺菲等.军事医学.2017，41(05)：338-341；Ashcom JD et al.Biocheml J.1997,328(Pt 1):245-250]，或再通过杂交瘤技术制备其单克隆抗体。然而，由于GI含有多个碱性氨基酸，与戊二醛偶联蛋白载体时反应位点多，影响了GI抗原表位，获得的鼠抗、兔抗或羊抗血清的中和活性或解毒活性不高。由于MI与GI结构相似，分子量小且亲水，抗原性弱，采用戊二醛法偶联至载体蛋白，也存在多反应位点影响抗原表位问题。前期发明人合成了MI多分支肽，虽然保持了MI抗原表位的完整性，免疫小鼠后虽有滴度，但抗毒活性不佳[陈荣芳等.生物技术通讯.2019，30(06)：768-774]。另，尝试用半胱氨酸方法偶联MI至蛋白载体，因MI本身含有两对二硫键，活泼的半胱氨酸导致MI不能正确折叠。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的α-芋螺毒素MI抗原，提高MI的免疫原性以获得抗血清、抗体，用于芋螺多肽MI中毒解毒或检测。

本发明提供了一种以α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白(BSA)的偶联蛋白抗原及制备方法。具体策略是先合成MI的含炔基多肽，用叠氮乙酸修饰BSA载体蛋白，利用点击反应制备MI-偶合载体蛋白抗原，然后免疫Balb/c小鼠、马获得抗血清、抗体，最后测定抗血清、抗体的中和活性与解毒活性。采用这种方法制备的MI-BSA偶联抗原能保持MI抗原表位不被修饰，免疫原性高，制备的鼠抗血清及马抗血清、抗体具有很高的中和活性及解毒活性，可应用于MI的中毒解毒及检测。