[发明专利]一种高纯人凝血酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种高纯人凝血酶的制备方法，属于生物制药领域。本发明从去冷沉淀人血浆中提取人凝血酶的方法，包括新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀；DEAE Sephadex A‑50凝胶吸附；超滤后料液激活；S/D病毒灭活；离子交换层析；除菌过滤；纳米膜除病毒过滤；分装；冷冻干燥。本发明通过改善人凝血酶的提取工艺，制得的人凝血酶，稳定性好，产品纯度高，安全可靠，比活可达2600IU/mg蛋白质以上，满足市场的需求，也提高了珍贵血浆资源的利用价值。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及血液制品的提取工艺，特别涉及一种人凝血酶的提取方法。

背景技术

人凝血酶是丝氨酸蛋白酶，分子量约37kd，白色无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。包含有两条由二硫键连接的两条链，轻链和重链的分子量分别为6000和31000，其活性部位在重链上。因为在血浆中存在高浓度的抗凝血酶，凝血酶只能存在几分钟，它是以凝血酶原的形式存在于血浆中，凝血酶原的含量很少，在正常血浆中含量在0.11～0.30mg/mL。因子Xa、V、钙离子和磷脂形成“凝血酶原酶复合物”，它是由凝血酶原在凝血酶原酶复合物的作用下，分别在精氨酸274一苏氨酸275和精氨酸323一异亮氨酸324两肽键处先后断裂形成的。因子Xa是此复合物的活性中心，单独因子Xa也能缓慢裂解凝血酶原。因子V经凝血酶和因子Xa激活成Va，比因子V活性更强，在激活凝血酶原的过程中起辅助因子作用。钙离子将因子Xa和凝血酶原连接于磷脂，Va通过其疏水区也连接与磷脂，磷脂的主要作用是提供活性表面。

凝血酶为止血药，临床上主要适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血；用于外伤、手术、口腔、耳、鼻、喉、泌尿、烧伤、骨科、神经外科、眼科、妇产科以及消化道等部位出血的止血。凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。而且还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。

凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，将广泛应用于临床。同时，除了传统的凝血作用外，凝血酶在脑血管病中的作用也日益受到重视，目前的研究表明，凝血酶不仅在脑出血、脑缺血中有毒性作用，在中枢神经系统正常发育和损伤保护中也有重要作用。临床研究体现出小剂量可产生神经保护作用，而大剂量则具有细胞毒性作用。因此，由于该药临床使用日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，生产前景看好。

目前常见的血浆中人凝血酶提取工艺为层析法，原料为去冷沉淀血浆或Cohn组分Ⅲ。国内现有相关发明专利两种原料提取工艺均有涉及，如专利《一种人凝血酶的制备方法》(申请号201610614283.8)，工艺为Cohn组分Ⅲ复溶、病毒灭活、阴离子交换层析、加入钙离子激活、阳离子交换层析、纳滤；专利《一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法》(申请号201510586400.X)，工艺为阴离子树脂吸附去冷胶血浆中凝血酶原，洗脱过滤得凝血酶原溶液，加入氯化钙溶液激活得凝血酶溶液，S/D病毒灭活，阳离子层析得纯化凝血酶溶液，再经过超滤透析浓缩，纳滤，除菌过滤，分装冻干，干热灭活得人凝血酶成品；专利《制备冻干人凝血酶的方法》(申请号201510520812.3)，工艺为以Cohn组分Ⅲ为原料，经等电点沉淀法制的人凝血酶原，氯化钙激活得人凝血酶粗品，S/D病毒灭活，SP-Sephadex C-50层析纯化得精制的人凝血酶，再经过超滤浓缩，添加稳定剂，纳滤，除菌过滤，冻干和干热得目标物。

本发明开发一种新的优化工艺提取人凝血酶，开发出适合于工业生产规模的人凝血酶制剂制备工艺，具有稳定性好，纯度高，病毒去除效果更好的特点的人凝血酶提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人凝血酶的提取方法，所制得的人凝血酶制剂纯度高，稳定性高，病毒灭活效果好。