[发明专利]一种高纯人凝血酶的制备方法

权利要求书

1.一种高纯人凝血酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；

（2）DEAE Sephadex A-50 凝胶吸附：在步骤（1）所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50 凝胶，干凝胶的加入量为0.5-1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速搅拌1.0-2.0小时，确保凝胶在溶液中混合均匀，转速不易太快，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，凝胶经过再生后保存可以重复使用；

平衡缓冲液采用为：0.01-0.02M枸橼酸钠，0.15-0.25M氯化钠，pH为7.0-8.0；

（3）超滤：将步骤（2）所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至5-20IU/mL，通过透析将电导调整至0.5-4.5ms/cm；

（4）激活：将步骤（3）所得料液进行除菌过滤，调整pH至6.5-7.5，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在30-80mM，2-8℃激活5-15天；

（5）压滤：向步骤（4）所得激活后悬浮液按5-20g硅藻土/kg料液比例添加硅藻土，三分之一硅藻土预铺板框，其余加入料液中，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；

（6）S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤（5）所得滤液中，添加完毕后，搅拌15-30min，添加时间≤30min，调整液温至24-26℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；

S/D病毒灭活液采用为：吐温-80溶度为1%(w/w)，TNBP浓度为0.3%(w/w)；

（7）离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤（6）所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个左右柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，然后用稀释液调整凝血酶效价500IU/mL；

平衡缓冲液采用为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.05-0.1M氯化钠，pH 6.5-7.5；洗涤缓冲液采用为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.1-0.3M氯化钠，pH 6.5-7.5；洗脱缓冲液采用为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.3-0.5M氯化钠，pH 6.5-7.5；稀释液配方为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.05-0.15M氯化钠，pH 6.5-7.5，其中丙氨酸也作为保护剂；

（8）除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；

（9）纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；

（10）分装；

（11）冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。