[发明专利]高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用

权利要求书

1.高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒，所述重组质粒含有生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸（GGPP）积累的关键基因和经密码子优化的生育三烯酚合成基因，所述生育三烯酚合成底物香叶基香叶基二磷酸（GGPP）积累的关键基因为HMG1和CrtE，所述经密码子优化的生育三烯酚合成基因编码的蛋白质为2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ-生育酚甲基转移酶；

所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶来自卷柏，其密码子优化序列如SEQ IDNO.1所示；所述生育酚环化酶来自石斛，序列如SEQ ID NO.2所示；所述γ-生育酚甲基转移酶来自甘蓝，序列如SEQ ID NO.3所示；所述HMG1和CrtE基因通过设计引物从解脂亚罗酵母工程菌po1f的基因组DNA扩增目的片段得到的；

所述重组质粒还含有Gene ID序号为103843547的来源于油菜的HPPD基因（BrHPPD）和GenBank序列号为MBR8827918.1的来源于蓝藻的HPT基因（GaHPT）。

2.权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：

（1）构建含有HPPD基因和HPT基因的解脂亚罗酵母工程菌

获取并合成来源于油菜的HPPD基因（BrHPPD）和来源于蓝藻的HPT基因（GaHPT）序列，与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp-BrHPPD-GaHPT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf-BHGH，所得重组菌株经通过菌落PCR验证正确；

（2）构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因的重组质粒

获取并合成来源于卷柏（SmMPBQMT）的2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因序列，以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因，分别连接获得重组质粒ploxpura3loxp-SmMPBQMT，将所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-BHGH中，获得重组菌株5，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；

（3）构建含有生育酚环化酶基因的重组菌株

获取并合成来源于石斛（DcTC）的生育酚环化酶基因序列，以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和所述生育酚环化酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-DcTC，所得重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，通过酵母转化试剂盒方法分别转入步骤（2）得到的重组菌株5中，获得重组菌株35，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；

（4）构建含有γ-生育酚甲基转移酶基因的重组菌株

获取并合成来源于甘蓝（Boγ-TMT）的γ-生育酚甲基转移酶基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和γ-生育酚甲基转移酶基因，连接获得重组质粒ploxpura3loxp-Boγ-TMT，所得重组质粒分别用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入步骤（3）的重组菌株35中，获得重组菌株38，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；

（5）构建过表达HMG1和CrtE基因的重组菌株

获取并合成HMG1和CrtE基因序列，设计引物从解脂亚罗酵母工程菌po1f的基因组DNA扩增目的片段，所得目的片段连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE；所得质粒分别转入菌株38中，获得重组菌株40，所得重组菌株经菌落PCR验证正确；

（6）目的基因的过表达

将前述获得的目的基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT分别连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-BrHPPD，pJN44-GaHPT，pJN44-SmMPBQMT，pJN44-DcTC，和pJN44-Boγ_TMT；将获得的质粒通过酶切验证后转入步骤（5）的重组菌株40中，得到高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母41（polf-(MTT)^＋HC-ura3），所得重组菌株经菌落PCR验证正确；

（7）去除ura3标记

所得重组解脂亚罗酵母41（polf-(MTT)^＋HC-ura3）在SD-LEU培养基上培养，所述SD-LEU培养基上生长的单菌落是高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母polf-(MTT)^＋HC。