[发明专利]一种同时监测两种microRNA的树形核酸结构的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种同时监测两种阿尔茨海默病相关microRNA(miRNA)的树形核酸结构的构建方法，在本方法中，两种miRNA以相互依赖的形式维持分支链的生长，在此机制下，只有两种miRNA同时存在时，才有可能形成树枝形高聚物。通过荧光分子标记，可对此高聚物进行区分。所提出的方法能够同时对两种miRNA进行定量分析，有望成为一种高效分析miRNA的方法，用于早期诊断阿尔茨海默病及其他疾病相关的miRNA。

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体是涉及同时监测两种microRNA的树形核酸结构的构建方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一种小的非编码RNA。其在细胞核内经DICER酶合成，被运输至细胞质参与基因的转录和调控。为确保其正常功能，细胞产生了一些能够整合miRNA的天然纳米结构来进行递送与调控。例如，外泌体可用于分拣与运送特定的miRNA至靶细胞参与细胞间的交流。另外，环状RNA能作为分子海绵来整合冗余的miRNA以降低过表达带来的损害。一个值得注意的例子是转录机器，多种miRNA常常协同参与转录机器的运行，促进基因表达调控。

受到这些结构的重要功能的启发，人工的能够整合功能性RNA的纳米结构被合成出来。这些结构能够模拟生物过程，促进其在生物医药领域的应用。其中，分支型核酸被认为是一种能够整合不同功能模块的理想材料。例如，RNA树形分子能够通过与miRNA杂交，在细胞内递送miRNA，并进行miRNA成像。与此相似，带有miRNA互补链的RNA胶束可以在体内结合多余的miRNA以抑制肿瘤的发展。然而，在这些方法中，分支的维持常常涉及多次加入预组装的单体分子，这使得操作繁琐耗时。另外，miRNA常常独立地整合进这些结构，分别输出信号，这就要求分别对捕获过程进行分析。这使得多种miRNA的生物模拟分析效率很低。因此能够以协同的方式一步整合不同miRNA的新型树形结构将促进多种miRNA的生物模拟分析，并拓宽核酸纳米结构的应用范围。

此外，miRNA是一种重要的生物标志物。据报道，作为疾病标志物，不同miRNA的联合检测比单个检测能更加准确的区分疾病。例如，阿尔茨海默症是一种与多个miRNA(如miR-18b-5p和miR-342-3p)有关的神经退行性疾病。对两种miRNA的同时分析被认为是早期诊断AD的有效指标。然而，传统的方法很难完成对两种标志物的同时分析。当前的方法，包括分子阵列，qPCR，RNA测序等，往往需要多次重复的操作。这限制了其在即时检测中的应用。基于此，我们认为，基于树形分子的异多价性和RNA的独特性质，对于双miRNA整合的树形分子的探究有望运用于阿尔茨海默症的早期快速诊断。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种同时监测两种microRNA的树形核酸结构的构建方法，能够同时对两种miRNA进行检测，用于疾病早期诊断。

本发明的另一目的在于提供一种该方法在同时检测疾病相关的两种miRNA中的应用。

技术方案：本发明所述同时监测两种miRNA的树形核酸结构的构建方法，包括如下步骤：

(1)、准备待检测疾病的两种miRNA，分别为miR-1和miR-2，以及两种连接DNA，分别为BL-1和BL-2，其中，BL-1的5’末端和3’末端能够分别与一条miR-1的5’端和另一条miR-1的3’末端相连，BL-2的5’末端和3’末端能够分别与一条miR-2的5’端和另一条miR-1的3’末端相连；

(2)、将步骤(1)中miR-1、miR-2、BL-1和BL-2分别溶于TE缓冲液中得到各自的溶液；

(3)、按一比一比例分别取BL-1溶液与BL-2溶液混合于杂交缓冲液中，然后按一比一比例向上述杂交缓冲液再加入miR-1溶液与miR-2溶液，将混合液先80℃～100℃变性10～20min，随后在1℃～6℃下孵育2h，得到整合了两种miRNA的核酸树形分子。