[发明专利]一种检测牛结节性皮肤病的Cycleave荧光PCR方法

说明书

本发明提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法；所提供的引物对和探针，其中引物对的正向引物的序列为SEQ ID NO:1，反向引物的序列为SEQ ID NO:2；探针的序列为SEQ ID NO:3。本发明所提供的Cycleave荧光PCR检测牛结节性皮肤病病毒的引物、探针及方法具有检测灵敏度高、特异性好、高通量和操作简便的优点。

技术领域

本发明属牛病病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测牛结节性皮 肤病的Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对和探针的检测方法。

背景技术

牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease，LSD)是一种由痘病毒科(Poxviridae)、羊痘病毒属(Capripoxvirus，CaPV)的牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus，LSDV)引起的急性、亚急性传染病，主要特征是发热，皮肤、粘膜上结 节样病变和淋巴结肿大等。

牛是该病毒的特异性宿主，发病可导致奶牛产奶量下降、公牛短暂或永久不 育、怀孕牛流产、皮革损坏以及继发细菌感染导致死亡。该病曾于非洲、中东、 东欧等地区多个国家流行并造成巨大经济损失。

检测时，通过发热、皮肤结节样变化、淋巴结肿大等临床症状可初步诊断该 病，但其确诊需依赖实验室检测，特别是疾病处于潜伏期或前驱期时。而且患病 牛产生皮肤损伤的症状易与皮肤癣病、昆虫叮咬等易混淆；发病期，患病牛结节 处可呈现黏膜坏死、破溃等症状，需与口蹄疫、蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛传染 性鼻气管炎等进行鉴别。此外，还存在无临床症状的隐性感染的情况，均需进行 实验室检测确诊。因此，开发快速、准确、简便的LSD特异性检测方法是防控该 病的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种Cycleave荧光PCR引物对、探针及应用该引物对 和探针的检测方法，从而实现对牛结节性皮肤病病毒特异、敏感、快速的检测。

本发明首先提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的引物对和探针，引物对和探 针序列信息如下：

牛结节性皮肤病病毒检测正向引物LSD forward：

5′-CGATACACTCTCCRATATC-3′(SEQ ID NO:1)

牛结节性皮肤病病毒检测反向引物LSD reverse：

5′-AACGAGAAGTATGAATTAGC-3′(SEQ ID NO:2)

牛结节性皮肤病病毒检测探针LSD probe：

其中，检测探针LSD probe的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭 基团Eclipse标记，下划线位置为标记的RNA位点。

上述引物和探针用于制备检测牛结节性皮肤病病毒的Cycleave荧光PCR检 测体系。

进一步，本发明还提供检测牛结节性皮肤病病毒核酸的Cycleave荧光PCR 方法，包括如下的步骤：

1)Cycleave荧光PCR反应体系配制

反应液每管25μL，含有2×Cycleave PCR反应液12.5μL，5pmol/μL的LSD forward和LSD reverse各0.6μL，5pmol/μL的LSD probe 0.8μL，双蒸水8.5μL， 待检测样品DNA模板2μL。其中，Cycleave PCR检测试剂盒(目录号：CY505A) 购自宝生物工程(大连)有限公司产品。

2)Cycleave荧光PCR反应体系扩增