[发明专利]视网膜色素上皮细胞的制备方法

说明书

本发明涉及一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：提供多能干细胞；将所述多能干细胞培养形成拟胚体；使用含有Dorsomorphin和SB431542的培养基对所述拟胚体进行悬浮培养；在所述悬浮培养之后，使用含有烟碱的培养基对所述拟胚体进行贴壁培养三周以上，并在所述贴壁培养的第2～3周于培养基中再添加Activin A进行培养，得到视网膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞前体。本发明的制备方法中培养基需要的添加成分较少，无动物源性成分，收获细胞数量大，诱导效率高，能为视网膜色素上皮细胞生产提供质量保证。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种视网膜色素上皮细胞的制备方法。

背景技术

利用人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)定向诱导为视网膜色素上皮(Retinal pigment epithelial，RPE)，目前已有一些方法。这种人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮(hESC-RPE)正在用于治疗眼底疾病的临床研究过程中。定向诱导人胚胎干细胞向RPE分化用于临床研究的主流方法为“自发分化法”，该方法直接去除了维持人胚胎干细胞不分化的因素，让其自发分化获得RPE细胞，再将其分离。除“自发分化法”以外，代表性的是于2009年在《Cell Stem Cell》上发表的方法，该方法添加了烟碱(NIC)和激活素A(Activin A)来提高RPE细胞的产量。其在诱导过程中始终添加NIC，第一周为悬浮培养，第二周至第六周为贴壁培养，且第三周至第四周添加Activin A，第六周可见含黑色素颗粒的RPE。此外，Dennies O Clegg于2013年发表在《Stem Cell Translational Medicine》上的文章显示添加IGF1、Noggin、Dkk1和bFGF可以快速在14天内获得RPE。

但是，“自发分化法”存在RPE形成的时间和效率均不可控的缺点，《Cell StemCell》上发表的方法获得RPE的速度也较慢，而Dennies O Clegg的方法需要添加的因子较多，成本较高，且批次差异大，质量难以控制。

发明内容

基于此，有必要提供一种需要的因子较少且效率较高的视网膜色素上皮细胞的制备方法，便于批量生产和质控，最终用于临床治疗。

一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：

提供多能干细胞；

将所述多能干细胞培养形成拟胚体；

使用含有Dorsomorphin和SB431542的培养基对所述拟胚体进行悬浮培养；

在所述悬浮培养之后，使用含有烟碱的培养基对所述拟胚体进行贴壁培养三周以上，并在所述贴壁培养的第2～3周于培养基中再添加Activin A进行培养，得到视网膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞前体。

在自然发育过程中，人体会经历由受精卵向内、中、外三个胚层发育的阶段。视网膜色素上皮从外胚层发育而来，中间主要经历神经外胚层、神经板、神经管几个发育阶段，再由神经管的吻端发育成前脑，至视泡再发育成视杯而来。本发明的制备方法在遵循视网膜色素上皮正常发育规律的基础上，在烟碱(NIC)联合激活素(Activin A)诱导眼发育前增加形成拟胚体并定向诱导神经外胚层的步骤，可以富集更多神经上皮细胞，有助于视网膜色素上皮细胞的高效诱导分化。经实验证明，通过增加悬浮定向诱导胚胎干细胞向神经上皮分化，再贴壁使用NIC和Activin A向眼方向诱导，第三周左右即可见棕黑色含色素颗粒的视网膜色素上皮细胞出现。第五周，当棕黑色视网膜色素上皮细胞或前体达到一定数量，可以挑拣出这些棕黑色视网膜色素上皮细胞进行后续纯化扩增，在第九周即可获得大量纯度为99％以上的视网膜色素上皮细胞。本发明的制备方法中培养基需要的添加成分较少，无动物源性成分，收获细胞数量大，诱导效率高，能为视网膜色素上皮细胞生产提供质量保证。