[发明专利]视网膜色素上皮细胞的制备方法

权利要求书

1.一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

提供多能干细胞；

将所述多能干细胞培养形成拟胚体；

使用含有Dorsomorphin和SB431542的培养基对所述拟胚体进行悬浮培养；

在所述悬浮培养之后，使用含有烟碱的培养基对所述拟胚体进行贴壁培养三周以上，并在所述贴壁培养的第2~3周于培养基中再添加Activin A进行培养，得到视网膜色素上皮细胞和视网膜色素上皮细胞前体；所述Dorsomorphin的工作浓度为0.2μM~5μM，所述SB431542的工作浓度为1μM~10μM；所述Activin A的工作浓度为5ng/mL~20ng/mL，所述烟碱的工作浓度为5μM~20μM；所述悬浮培养的时间为4~9天；所述多能干细胞为人胚胎干细胞。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述多能干细胞培养形成拟胚体包括以下步骤：将所述多能干细胞消化形成单细胞，然后接种于细胞成球培养板中培养以形成所述拟胚体。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将所述多能干细胞培养形成拟胚体时，每1000个~3000个多能干细胞培养形成一个拟胚体。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述贴壁培养的时间为3~5周。

5.根据权利要求1~4任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：将所述贴壁培养中出现的视网膜色素上皮细胞和/或视网膜色素上皮细胞前体挑拣出，消化松散过筛后以单细胞接种于RPE细胞扩增培养基中进行扩增培养。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述视网膜色素上皮细胞和/或视网膜色素上皮细胞前体以(2~5)×10⁴个/cm²的密度接种于RPE细胞扩增培养基。