[发明专利]一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法。本发明将TRV‑VIGS系统首次应用于蝴蝶花基因功能研究。通过建立快速高效的蝴蝶花病毒介导的基因沉默系统，确定最适蝴蝶花侵染受体、最佳菌液浓度、最佳侵染部位，并采用叶背十字切割注射法对蝴蝶花植株进行侵染等，显著提高了农杆菌侵染及基因沉默的效率，实现在基因组规模上高通量、功能性分析单子叶植物中鸢尾属植物基因功能。本发明的基因沉默体系简便、快速、高效，可为解析蝴蝶花重要性状分子机制奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种蝴蝶花VIGS基因沉默体系的构建方法。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解，相应表型发生变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反应该基因功能。VIGS技术具有快速、高效、通量高等优点，能够方便快捷地研究基因功能，甚至可以用来研究一些突变后会致死的基因功能，因此该技术被广泛应用于植物生长发育、抗病虫、代谢调控等方面功能基因研究中。

蝴蝶花(Iris japonica)为鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属宿根花卉，其花叶俱佳，四季常绿，生长适应性强，从我国广东省至陕西省均有分布，是一种良好的园林地被植物。但蝴蝶花遗传再生相对困难，以花器官作为外植体进行愈伤组织诱导效率极低，自然结实率低且种子具休眠特性亦无法用种胚作为外植体，以地下根茎作为外植体则消毒困难，诱导效率也很低，因此利用转基因技术验证蝴蝶花基因功能尚存在技术瓶颈。模式植物中研究已证实：VIGS技术试验周期短，不依赖转基因操作，具有低成本、高通量等优点，目前该技术仍较少应用于单子叶植物中。建立以鸢尾为代表的单子叶植物VIGS技术体系，可快速有效地对该类植物关键基因进行功能验证，对于解析其重要性状分子机制具有理论和实践意义，为实现我国花卉分子育种奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种蝴蝶花基因沉默体系构建方法，包括下述步骤：

(1)蝴蝶花目的基因片段的克隆

根据蝴蝶花转录组数据注释为目的基因的转录本保守区域设计酶切引物(产物长度约为200-300bp)，并在正向和反向引物5’端分别添加限制性内切酶Xba I和Sac I的识别碱基，以及保护碱基序列GCTCTAGA和CGAGCTC；

提取蝴蝶花RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得目的基因片段；电泳，切胶回收PCR产物；连接pEASY-blunt载体，转化大肠杆菌DH5α感受态；37℃暗培养过夜后挑取单克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性；

(2)构建含蝴蝶花目的基因TRV载体的根癌农杆菌

提取步骤(1)中经测序验证的含有蝴蝶花目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒；使用Xba I和Sac I两个限制性内切酶对该克隆载体质粒和pTRV2质粒进行酶切，酶切条件37℃、40分钟；电泳、切胶回收目的基因和pTRV2载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将目的基因和pTRV2载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃、3小时；

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，37℃暗培养过夜后挑取单克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物pTRV2-F(5’-TGGGAGATGATACGCTGTT-3’，SEQ ID NO.1)和pTRV2-R(5’-CCTAAAACTTCAGACACG-3’，SEQ ID NO.2)进行阳性单克隆PCR检测并测序；

提取获得的阳性克隆质粒，使用冻融法转化农杆菌GV3101，28℃暗培养两天后挑取单克隆，使用pTRV2-F和pTRV2-R引物进行阳性单克隆PCR检测；