[发明专利]一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法

权利要求书

1.一种蝴蝶花基因沉默体系的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)蝴蝶花目的基因片段的克隆

根据蝴蝶花转录组数据注释为目的基因的转录本保守区域设计酶切引物，并在正向和反向引物5’端分别添加限制性内切酶Xba I和Sac I的识别碱基，以及保护碱基序列GCTCTAGA和CGAGCTC；

提取蝴蝶花RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增获得目的基因片段；电泳，切胶回收PCR产物；连接pEASY-blunt载体，转化大肠杆菌DH5α感受态；37℃暗培养过夜后挑取单克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性克隆后，测序确认PCR产物的正确性；

(2)构建含蝴蝶花目的基因TRV载体的根癌农杆菌

提取步骤(1)中经测序验证的含有蝴蝶花目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒；使用Xba I和Sac I两个限制性内切酶对该克隆载体质粒和pTRV2质粒进行酶切，酶切条件37℃、40分钟；电泳、切胶回收目的基因和pTRV2载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将目的基因和pTRV2载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16℃、3小时；

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，37℃暗培养过夜后挑取单克隆，使用载体酶切位点两侧序列设计的引物pTRV2-F和pTRV2-R进行阳性单克隆PCR检测并测序；

提取获得的阳性克隆质粒，使用冻融法转化农杆菌GV3101，28℃暗培养两天后挑取单克隆，使用pTRV2-F和pTRV2-R引物进行阳性单克隆PCR检测；

(3)以农杆菌介导侵染蝴蝶花植株

将含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-报告基因、pTRV2-目的基因片段的农杆菌GV3101菌液50-100μL加入至5mL含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的Luria-Bertani培养液，放入摇床中28℃、200rpm摇菌16小时，再转入含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平、10mM MES和20μM AS的150ml LB液体培养基，放入摇床中28℃、200rpm摇菌16小时；当菌液的OD₆₀₀为1.5-2.0时，4000rpm、25℃离心10分钟收集菌体；用含有10mM MgCl₂、10mM MES、200μM AS的150ml侵染缓冲液分别重悬菌体；取含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2的农杆菌GV3101菌液，按照体积比1:1混合以此用于参照系；取含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2-报告基因的农杆菌GV3101菌液，按照体积比1:1混合；取含有pTRV1的农杆菌GV3101菌液与含有pTRV2-目的基因片段的农杆菌GV3101菌液，按照体积比1:1混合；25℃避光静置活化4小时；

以混合后的农杆菌GV3101菌液分别对蝴蝶花植株进行侵染处理；将植株在湿度60％，20-21℃环境暗培养3天之后，改为在湿度60％，光照14-16小时、25℃、4000lxs/黑暗10-8小时、18℃条件继续培养直至出现表型；

(4)基因沉默植株的检测

首先经过一段时间观察，记录侵染植株形态变化；选择其中出现预期表型的植株，提取其叶片总RNA并反转录成cDNA，使用pTRV2-F和pTRV2-R引物进行PCR，检测带目的基因的pTRV2重组载体是否进入植物体内；使用qPCR对野生型、仅转入pTRV2空载和含目的基因-pTRV2重组载体的植株进行目的基因表达定量，其中目的基因表达量较低的植株即为基因沉默成功的植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述报告基因具体是指绿色荧光蛋白；所述蝴蝶花转录组数据注释为目的基因的转录本保守区域，具体是指：蝴蝶花转录组数据注释为蝴蝶花八氢番茄红素脱氢酶PDS转录本保守区域。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中进行侵染处理时，所用蝴蝶花植株是苗龄为1年生植株。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中进行侵染处理时，侵染部位包括根状茎、茎尖或叶片；其中，

(1)以根状茎和茎尖为侵染对象时，侵染前先用1ml注射器针头在根状茎或茎尖扎2-3个孔，随后将扎孔部位淹没在侵染液中，将其放入真空泵中-0.9kg/cm²抽真空30分钟，放气20分钟；

(2)以叶片为侵染对象时，先用1ml注射器针头在蝴蝶花叶片背部轻轻划十字，但切勿划穿，再用去掉针头的1ml注射器，将上述各混合液分别对准十字中心注射。