[发明专利]基于绿色溶剂及可编程寡核苷酸探针的多重定位检测多种靶标的方法

说明书

本发明公开基于绿色溶剂及可编程寡核苷酸探针的多重定位检测多种靶标（例如细胞内的蛋白质或其它靶标）的方法，所述方法将靶标特异性寡核苷酸与靶标直接或间接相连，将其中一个或几个靶标连接的寡核苷酸特异性地连接对应荧光探针，通过对荧光探针的定位检测实现对应靶标的定位分析。为了实现更多重靶标定位分析，所述方法使用绿色溶剂去除已经检测过的荧光探针，然后再将其它未分析靶标上的寡核苷酸特异性地连接上对应荧光探针，进而再次通过对荧光探针的定位检测实现其它对应靶标的定位分析。因此，该方法不会受到不同特异性荧光探针信号交叉的影响，也不会受到荧光检测设备检测通道数有限的阻碍，可实现多重靶标定位分析。

技术领域

本发明属于待测试样本中多重靶标定位检测的领域，具体涉及基于绿色溶剂及可编程寡核苷酸探针的多重定位检测多种靶标的方法。

背景技术

细胞是构成生物体的基本单元；生物体所有生理功能的执行均通过各种类型细胞间通讯及其相互协作来实现。因此，阐明机体器官和组织中各个细胞发挥生物功能的分子机制十分重要。也因此在生物环境的原位背景下，表征单个细胞及组织样本的分子组成对深入探索生命活动与疾病发生机制是至关重要的。

免疫荧光成像技术是生物样本(如细胞或组织)中分子靶标表征的理想工具，它能够保持分子靶标在样本中的原始位置，从而获得准确的位置信息。但由于荧光团光谱重叠，荧光显微镜检测通道有限，免疫荧光方法的多重检测能力受到了限制，该方法一般只能实现3～5个靶标的检测。在国内外的研究中，已经报道了各种用于规避荧光光谱重叠限制的技术方法，包括分批次的免疫抗体染色、靶标多轮次成像的方法。但这类方法耗时较长，如每轮抗体染色孵育在常温下一般需要2小时以上，4摄氏度环境下一般需要12～16个小时，因此在实践中并未得到广泛使用。另外一类方法是同时进行针对所有待分析靶标的抗体孵育，这些抗体分别预先标记有寡核苷酸标签，以进行靶标的区分检测，然后再利用荧光探针对这些靶标的抗体进行分批次的荧光成像。该类方法每一次对其中一个或几个靶标的抗体进行检测，再通过使用甲酰胺等变性剂实现荧光探针与目标的解离，然后进行其它一个或几个靶标的检测，如此循环往复实现了不同特异性荧光探针与目标杂交结合\解离的循环过程，规避了荧光光谱重叠的限制，实现了更多靶标的检测分析。与分批次抗体染色的方法相比，这种方法提高了多靶标检测的速度，但是需要反复依赖有毒试剂进行荧光探针的解离，不利于真正实践中人员及环境保护；此外，此类方法没有信号放大过程或信号放大不足，难以对低丰度分子靶标的有效检测，尤其是当待测试样本中存在常见的荧光散射及荧光背景影响的条件下。因此，需要对现有技术进行革新，提供一种具有多重检测能力并且灵敏度高的生物样本中分子靶标检测的有效技术方法。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种具有多重检测能力并且灵敏度高的生物样本中分子靶标检测的有效技术方法。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了基于绿色溶剂及可编程寡核苷酸探针的多重定位检测多种靶标的方法，所述多重定位检测多种靶标的方法通过将待测靶标分别直接或间接连接特异性寡核苷酸，将与靶标连接的寡核苷酸特异性地连接对应的荧光探针，通过对荧光探针的定位检测实现对应靶标的定位分析，然后使用绿色溶剂去除已经检测过的荧光探针，然后再将其它未分析靶标上的寡核苷酸特异性地连接上对应荧光探针，进而再次通过对荧光探针的定位检测实现其它对应靶标的定位分析。

其中，所述靶标是指存在于待测样本中的分析物，其中所述样本为细胞、组织、细胞提取物、组织提取物或细胞分泌物中的一种或多种；所述分析物为核酸、蛋白质、多肽、脂蛋白、糖蛋白中的一种或多种。应当理解，在分析样本之前，其包含靶标是已知的、怀疑的、未知的或不被怀疑的。

其中，每种靶标只与特定序列的寡核苷酸直接或间接地相互作用，其中所述间接作用是指靶标与特定的中间分子直接作用，而该中间分子连接有特定序列的寡核苷酸，其中所述中间分子是至少一种抗体、抗体片段、寡核苷酸、适配体、小分子，该中间分子具有靶标特异性。