[发明专利]一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法

权利要求书

1.一种基于中国青鳉的化学品毒性高内涵快速筛查方法，其特征在于，包括采用中国青鳉胚胎、细胞、幼鱼或精子检测化学品毒性的方法，其中：

采用中国青鳉胚胎检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：

1-1)将规范化养殖的中国青鳉雌雄成鱼按照1:2的个数比例放入交配盒中，并将雌雄成鱼隔开；过夜后取消隔档，并光照刺激中国青鳉交配产卵，收集鱼卵并用水清洗后镜检，随机选取发育正常的胚胎放入纯净水中培养一预定的时间；

1-2)将化学品用DMSO溶解，再用纯净水稀释至各实验梯度；在孔板的每孔内放置1个胚胎，加入系列实验梯度的化学品和DMSO对照品，进行暴露实验，实验过程中每隔半天更换一半的处理液；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少10个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；

1-3)在暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中的各项指标，通过胚胎的形态学打分、心率、行动和孵化率指标判断化学品对胚胎发育的影响，通过胚胎的畸形率和致死率指标判断化学品对胚胎的影响，通过观察胚胎的体节、卵黄囊、心脏、血管、神经、眼点组织器官的发育畸形情况判断化学品的致畸性，通过检测胚胎及孵化子代性腺发育判断化学品的雌激素或雄激素活性；

采用中国青鳉细胞检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：

2-1)提取至少3只中国青鳉幼鱼的组织，多次洗涤后，制成组织块，加入胰蛋白酶-EDTA，至组织松散；吸出多余的胰蛋白酶-EDTA，加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液，过筛，离心；弃掉上清液，加入完全培养基重悬细胞，调整细胞密度，培养过夜；

2-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用完全培养基稀释至各实验梯度；除去原培养基，加入系列浓度的化学品和DMSO对照品并继续培养一天，每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；

2-3)对细胞加入化学品进行荧光染色，避光孵育；用无菌PBS缓冲液洗涤，并再加入无菌PBS缓冲液，利用高内涵成像分析系统进行活细胞成像扫描，分析各个图像中的荧光强度，根据荧光强度定量检测指标，该检测指标包括细胞数目、DNA含量、谷胱甘肽降低水平、活性氧簇含量和线粒体膜电位；根据该检测指标绘制量效关系曲线，并确定毒性阈值，判断化学品的毒性；

采用中国青鳉幼鱼检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：

3-1)随机选取同一批次发育正常的胚胎，放入纯净水中培养使其孵化，待幼鱼孵出后继续进行驯养，驯养一段时间后随机选取形态大小接近、健康的中国青鳉幼鱼；

3-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用纯净水稀释至各实验梯度；在孔板的每个孔内放置1条幼鱼，加入系列实验梯度的化学品和DMSO对照品，进行暴露实验；实验过程中每隔一天更换一半的处理液，每天定量喂食2次，试验过程中不曝气；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置至少8个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；

3-3)在暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中幼鱼的评价指标，通过幼鱼的形态学打分和行动指标考察化学品对幼鱼发育的影响，通过胚胎幼鱼的畸形率和致死率指标考察化学品对幼鱼的影响，判断化学品的毒性；

采用中国青鳉精子检测化学品毒性的方法，包括以下步骤：

4-1)提取多条性成熟中国青鳉雄鱼的精子，制备成精子悬浮液，分装，并在2h内进行精子暴露实验；

4-2)将化学品用DMSO溶解制备高浓度母液，再用含盐养殖水稀释至各实验梯度；用孔板加入系列实验梯度的化学品/对照品，混合均匀后进行暴露实验；每个化学品至少设置3个剂量组，每个剂量组设置2个复孔，同时设置阴性对照组和阳性对照组；

4-3)暴露实验过程中，通过高内涵成像分析系统进行成像扫描，分析各个图像中精子的形态及运动状况；检测运动精子的数量占视野中所有精子总数的比例，统计精子的运动率、平均直线速度、平均曲线速度、平均圆周速度指标，确定毒性阈值，判断化学品毒性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1-1)中，规范化养殖中国青鳉的方法为：中国青鳉在独立养殖系统中进行养殖，养殖用水采用充分曝气处理的循环水，水温25±1℃，水硬度8.0mg/L，pH控制在8.0左右，溶解氧8.0-9.0mg/L，光照周期昼夜比为14h:10h；驯养过程中饵料为新孵化的丰年虾幼虫，每日喂食2次。