[发明专利]临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法

说明书

本发明提出临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法，其中，该临近标记复合物通过构建蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白，蛋白A可以特异性的与目标蛋白的抗体结合，通过特异性的抗体介导临近标记复合物与目标蛋白的紧密结合，不需要在细胞内构建抗坏血酸过氧化物酶与诱饵蛋白的融合蛋白，该临近标记复合物不受限于基因编辑，且能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题，通过该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及临近标记复合物、临近标记方法、分子间互作分析方法。

背景技术

许多生物过程是通过蛋白质和核酸的分子相互作用来执行和调节的，包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质-DNA相互作用。这些相互作用关系的失衡会导致人类各种疾病的发生，如癌症、免疫失调和神经退行性疾病等。因此，研究细胞中这些分子间的相互作用的方法对了解人类疾病的生物学过程及其治疗提供有利的工具。

临近标记技术常被用来研究生物分子间的相互作用，其是通过运用基因编辑将工程化酶，例如过氧化物酶APEX/APEX2和HRP或生物素连接酶BioID、BASU、TurboID和miniTurbo等，与诱饵蛋白在细胞内融合表达，再利用生物素来标记与诱饵蛋白结合的目标蛋白邻近的相互作用的蛋白质、DNA或RNA，然后通过生物信息学分析或质谱鉴定进一步了解与目标蛋白相互作用的分子。

其中，工程化抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)是由源自植物的抗坏血酸过氧化物酶经工程改造而来。Ting等人研究证明，APEX2在活细胞内所有区域有活性，并可以利用生物素苯酚(Biotin-phenol,BP)催化生成活性强、半衰期短、膜不通透的活性分子，因此可以实现对特定亚细胞区域内或间隙中蛋白质组的标记。将细胞与生物素苯酚共同孵育30分钟后，添加过氧化氢(H₂O₂)可以激活酶促反应，生成生物素-苯氧自由基，这些自由基与富含电子的特定氨基酸(如Tyr、Trp、Cys和His)反应，使生物素被共价连接到蛋白质或核酸分子上，接着标记反应需要添加抑制剂来终止。由于苯氧自由基的半衰期很短(1ms)，只有距离目标蛋白20nm以内的蛋白、DNA和RNA会被标记，1分钟内即可完成所需的标记。

生物素标记的分子通过偶联链霉亲和素的磁珠进行亲和富集，最后利用质谱技术、DNA-seq或RNA-seq或相对定量PCR(qPCR)对生物素修饰的分子进行鉴定，得到目标蛋白的邻近蛋白质组、DNA或RNA。

基于APEX2技术的临近标记主要有以下个优点：1)苯氧自由基的寿命很短，在1ms以内，所以理论上只能标记空间范围在20nm以内的蛋白，和标记范围是200-300nm的HRP方法相比，极大地降低了假阳性的结果。2)自由基的活性很高，反应速度极快，标记反应只需要1分钟，所以无论对于瞬时的生物过程还是长时程的生物过程，APEX2技术都能很好地实现临近标记。

但是这些方法具有一定的局限性：1)需要用工程化酶在细胞内表达外源融合蛋白，这限制了其在难以转染的细胞系、原代细胞、组织和病理样品中的应用；2)不能应用于翻译后修饰的蛋白(例如组蛋白修饰)；3)当在细胞中融合工程化酶时，可能会造成诱饵蛋白功能的丧失，以及与其相互作用蛋白的改变，从而造成假阳性。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种临近标记复合物，旨在解决现有临近标记方法受限于基因编辑，且不能够应用于翻译后修饰的蛋白的问题，该临近标记复合物鉴定与目标蛋白相互作用的分子有效性高。

为实现上述目的，本发明提出一种临近标记复合物，包括蛋白A和抗坏血酸过氧化物酶的融合表达蛋白。

可选地，所述蛋白A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提出一种试剂盒，包括上述的一种临近标记复合物。

可选地，所述试剂盒还包括生物素苯酚和过氧化氢。