[发明专利]一种化学修饰的木聚糖酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种化学修饰的木聚糖酶及其制备方法和应用，属于酶工程领域。利用NaIO₄的氧化特点，将右旋糖酐上的羟基氧化为醛基后对木聚糖酶进行化学修饰。修饰后的酶拥有右旋糖酐结构，可以与木质纤维素中纤维素结合，达到一种固定化作用，从而使酶活力提高了237%，同时拥有更高的最大反应速率Vmax，该方法克服了木聚糖酶在木质纤维素中反应速率低的缺点，提高了木聚糖酶的催化活性，具有广阔的工业应用前景。

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种化学修饰的木聚糖酶及其制备方法和应用。

背景技术

木聚糖是植物半纤维素的主要成分，是除纤维素之外自然界最为丰富的多糖。木聚糖主链是由β-D-毗喃木糖残基通过β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物。植物中的木聚糖位于木质素和纤维素之间，木聚糖和木质纤维的其它成分之间存在着不同程度的相互作用。木聚糖主要以共价键与木质素相连接，以非共价键与纤维素作用。木质纤维素降解的难点之一就是由于其复杂的结构导致降解困难，因此通过对木聚糖酶进行化学修饰，使其与右旋糖酐相连，使其能够与纤维素结合，达到一种固定化的作用，从而提高亲和性，促进木质纤维素的降解。虽然酶的化学修饰可以改变酶的某些性质，提高其使用效率，但在修饰过程中往往会破坏酶分子的结构，降低了酶的活性，所以需要对酶的化学修饰条件进行优化，包括修饰时间、温度和pH，以降低酶活性的损失。

发明内容

本发明提供一种化学修饰的木聚糖酶及其制备方法和应用，本发明合理设计并优化了修饰方法，克服了现有技术的不足，用该方法化学修饰的木聚糖酶对纤维素具有较高的亲和性，提高了木质纤维素的降解效果。

本发明的第一个目的是提供一种化学修饰的木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码基因如SEQ ID NO:2所示，化学修饰剂为右旋糖酐。

进一步的，所述化学修饰剂为含有醛基的右旋糖酐，与木聚糖酶通过氨基酸的氨基进行偶联。

进一步的，所述含有醛基的右旋糖酐采用NaIO4氧化右旋糖酐的邻羟基获得。

进一步的，所述含有醛基的右旋糖酐采用150kDa的右旋糖酐。步骤如下：将木聚糖酶编码基因片段和表达载体pET28a(+)相连接，并将连接产物转化至大肠杆菌BL21，获得重组菌株；培养重组菌株，诱导表达；发酵液破碎离心后盐析纯化，获得所述木聚糖酶的酶液。

本发明的第二目的是提供化学修饰的木聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)木聚糖酶的制备

将木聚糖酶编码基因与表达载体pEt28a(+)相连接，并将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，获得重组菌株；培养重组菌株进行发酵表达，发酵液破碎离心后，将上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换柱纯化，获得木聚糖酶液。

(2)含醛基右旋糖酐的制备

避光下将2.4g NaIO₄溶于10mL纯水制得NaIO₄溶液，将其倒入10mL浓度为2g/mL的右旋糖酐溶液中，室温下避光搅拌8h。反应完成后加入5mL的乙二醇反应2h后，反应液在8000-14000的透析袋中，过夜透析。

(3)木聚糖酶化学修饰物的制备

本发明的第三目的是提供上述化学修饰的木聚糖酶的应用，用于木质纤维素快速降解。

本发明的有益技术效果是：与未修饰的木聚糖酶相比，修饰后的木聚糖酶和纤维素具有了一定的结合力，达到一种固定化作用，从而使其在木质纤维素的分解过程中具有更高的反应速率，同时其米氏方程的Km下降，表明与木聚糖的亲和力也得到增加。

附图说明

图1不同时间下修饰反应后的酶活检测

图2不同pH下修饰反应后的酶活检测