[发明专利]用于pAPN基因定点修饰的系统及其应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于pAPN基因定点修饰的系统及其应用。本发明提供用于pAPN基因定点修饰的系统，该系统中含有的第一载体和第二载体可以表达基因编辑蛋白和sgRNA，对pAPN基因的两个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的定点修饰片段替换位于两个靶位点之间的待定点修饰片段，实现pAPN基因第738位氨基酸的精准突变，T738替换为V738。在精确修饰pAPN基因第738位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变pAPN基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于pAPN基因定点修饰的系统及其应用。

背景技术

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触传染性疾病，主要引起猪腹泻、呕吐、脱水和死亡，其中初生仔猪中死亡率高达100％。因此TGE被认为是危害养猪产业的重要传染病之一。

pAPN蛋白被认为是TGEV(transmissible gastroenteritis virus)进入细胞的关键受体。至今，已有多个单位成功制备出了pAPN基因敲除猪，且攻毒实验证实pAPN基因敲除可完全抵抗TGEV感染。但是，除了在介导TGEV入侵方面发挥着重要作用外，pAPN在小肠中还发挥水解肽、酰胺等结构中的酰胺键，从而释放不同的N-中性氨基酸的作用。同时pAPN蛋白在其他组织中还参与很多重要的生理过程，例如细胞生长、免疫调节和血压调节等。因此直接对pAPN进行敲除可能影响机体的其他生理功能。

因此，开发一种既能够抵抗TGEV感染、又能保持pAPN蛋白正常生理功能的基因编辑猪尤为重要，在猪抗病育种方面具有重要的科学和实际意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于pAPN基因定点修饰的系统。

本发明的第二目的在于提供上述系统的应用。

本发明的第三目的在于提供pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法。

本发明的第四目的在于提供上述制备方法得到的细胞。

本发明的第五目的在于提供pAPN基因定点修饰的基因编辑猪的制备方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种用于pAPN基因定点修饰的系统，含有第一载体、第二载体和供体DNA；

所述第一载体包括基因编辑蛋白表达盒和第一sgRNA表达盒；

所述第二载体包括基因编辑蛋白表达盒和第二sgRNA表达盒；

第一sgRNA和第二sgRNA分别靶向pAPN基因的两个靶位点；

所述供体DNA含有pAPN基因第738位氨基酸的定点修饰片段，所述定点修饰片段用于替换pAPN基因待定点修饰片段；

所述pAPN基因待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间；

所述pAPN基因定点修饰为pAPN基因T738替换为V738。

进一步地，编码所述第一sgRNA为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

优选地，编码所述第二sgRNA为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述pAPN基因定点修饰为将编码pAPN基因第738位氨基酸的ACC替换为GTC。

进一步地，所述供体DNA为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。