[发明专利]用于pAPN基因定点修饰的系统及其应用有效
| 申请号： | 202110985540.X | 申请日： | 2021-08-26 |
| 公开（公告）号： | CN113957093B | 公开（公告）日： | 2022-09-20 |
| 发明（设计）人： | 李奎;牟玉莲;徐长江;刘志国 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/113;C12N15/12;C12N15/57;C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京超凡宏宇专利代理事务所(特殊普通合伙) 11463 | 代理人： | 徐乐 |
| 地址： | 100193 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 papn 基因 定点 修饰 系统 及其 应用 | ||
1.一种用于pAPN基因定点修饰的产品，其特征在于，含有第一载体、第二载体和供体DNA；
所述第一载体包括基因编辑蛋白表达盒和第一sgRNA表达盒；
所述第二载体包括基因编辑蛋白表达盒和第二sgRNA表达盒；
第一sgRNA和第二sgRNA分别靶向pAPN基因的两个靶位点；
所述供体DNA含有pAPN基因第738位氨基酸的定点修饰片段，所述定点修饰片段用于替换pAPN基因待定点修饰片段；
所述pAPN基因待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间；
所述pAPN基因定点修饰为pAPN基因T738替换为V738。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，编码所述第一sgRNA为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，编码所述第二sgRNA为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述pAPN基因定点修饰为将编码pAPN基因第738位氨基酸的ACC替换为GTC。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述供体DNA为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5任一项所述的产品，其特征在于，所述基因编辑蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述基因编辑蛋白为Cas9。
8.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述第一载体和第二载体均独立地包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述第一载体和第二载体均独立地为pX458。
10.权利要求1-9任一项所述的产品在如下(a)-(c)中的应用，所述应用为非诊断和治疗目的的：
(a)构建pAPN基因定点修饰的细胞系；
(b)制备预防猪传染性胃肠炎的产品；
(c)构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型。
11.一种非诊断和治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法，其特征在于，包括向目的细胞导入权利要求1-9任一项所述的产品，得到pAPN基因定点修饰的细胞。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述目的细胞为猪成纤维细胞。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述目的细胞为猪胎儿成纤维细胞。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法。
15.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，导入操作后通过筛选和鉴定，得到pAPN基因定点修饰的细胞。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞。
17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述鉴定包括测序鉴定。
18.权利要求11-17任一项所述制备方法得到的细胞。
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