[发明专利]pAPN基因第16外显子的基因编辑系统及其应用

说明书

本发明涉及基因工程领域，具体而言，提供了一种pAPN基因第16外显子的基因编辑系统及其应用。本发明提供的基因编辑系统，sgRNA对可以引导核酸内切酶分别靶向pAPN基因第16外显子的两个目标靶位点，并且进行切割编辑，实现pAPN基因第16外显子缺失69bp，同时pAPN基因的其余氨基酸正常表达。pAPN基因编辑后，细胞可以有效抵抗TGEV感染，同时其他蛋白生理活性功能不受影响，具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种pAPN基因第16外显子的基因编辑系统及其应用。

背景技术

猪传染性肠胃炎(transmissible gastroenteritis of pigs,TGE)是由传染性肠胃炎病毒引起的急性、高度接触性胃肠道传染病。各年龄的猪均能感染，十日龄以内的仔猪最易感染，七日龄以内的仔猪感染发病死亡率可达100％。

pAPN蛋白被认为是TGEV(transmissible gastroenteritis virus)进入细胞的关键受体。至今，已有多个单位成功制备出了pAPN基因敲除猪，且攻毒实验证实pAPN基因敲除可完全抵抗TGEV感染。但是，除了在介导TGEV入侵方面发挥着重要作用外，pAPN在小肠中还发挥水解肽、酰胺等结构中的酰胺键，从而释放不同的N-中性氨基酸的作用。同时pAPN蛋白在其他组织中还参与很多重要的生理过程，例如细胞生长、免疫调节和血压调节。因此直接对pAPN进行敲除可能影响机体的其他生理功能。

因此，开发一种既能够抵抗TGEV感染、又能保持pAPN蛋白正常生理功能的基因编辑猪尤为重要，在猪抗病育种方面具有重要的科学和实际意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种pAPN基因第16外显子的基因编辑系统。

本发明的第二目的在于提供上述基因编辑系统的应用。

本发明的第三目的在于提供一种猪pAPN基因第16外显子修饰的试剂盒。

本发明的第四目的在于提供一种pAPN基因第16外显子修饰的细胞的制备方法。

本发明的第五目的在于提供上述制备方法得到的细胞。

本发明的第六目的在于提供一种用于猪pAPN基因第16外显子修饰的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种pAPN基因第16外显子的基因编辑系统，包括核酸内切酶和sgRNA对；

所述sgRNA对包括pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2；

编码pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

编码pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，所述核酸内切酶和sgRNA对的编辑载体包括编辑载体1和编辑载体2；

编辑载体1表达核酸内切酶和pAPN-sgRNA-1；

编辑载体2表达核酸内切酶和pAPN-sgRNA-2。

进一步地，编辑载体1和编辑载体2的载体骨架独立地包括CRISPR质粒；

优选地，所述CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，优选为CRISPR/Cas9；