[发明专利]一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞

说明书

本发明提供一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA，所述sgRNA用来敲除PD1基因；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到稳定表达PD1的293T细胞中，对PD1基因的敲除率为71.92‑90.97%；转染到T细胞中，对PD1基因的敲除率为58.26‑72.67%；本发明所述针对人PD1基因的sgRNA靶点，转染到T细胞中，得到Crispr‑PD1‑T细胞，对结肠癌细胞系LoVo均表现出显著的特异性细胞毒性作用并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。

技术领域

本发明涉及一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞，属于基因工程技术领域。

背景技术

PD-1(程序性死亡受体1，programmed death 1) 蛋白属于免疫球蛋白超家族成员，可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4^-CD8^-胸腺细胞。PD-1有两个配体，即PD-L1（B7-H1）和PD-L2（B7-DC），均为B7家族中的新成员。PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1、PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。T细胞上的PD-1与肿瘤细胞中的PD-L1/ PD-L2的结合，可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。

Crispr/Cas9技术是非常热门的基因编辑操作工具，目前华西医院已报道利用Crispr技术敲除T细胞中的PD1，具有安全无副作用的优势。目前用于设计sgRNA的网站有十多个，同一个基因设计出来的sgRNA序列多达数百个，其每个sgRNA导入细胞内后造成的敲除效率是不同的，需要筛选出敲除效率高的sgRNA。

CN103820454B专利虽然提供了180个PD1的sgRNA序列，但只给出了其中4个单sgRNA和4个双sgRNA的效果，对于其余sgRNA并没有验证其敲除效率。CN107586777A专利虽然也提供了131个sgRNA，但对于其效果只提供了sgRNA活性，没有涉及具体的敲除效率。

CN105671083B专利仅公开了一个sgRNA序列的效果，其余sgRNA序列具有的敲除效率是未知的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞，实现以下发明目的：

筛选出高敲除率的sgRNA，提高T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案

一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA，所述sgRNA是敲除PD1基因的靶点；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。

以下是对上述技术方案的进一步改进：

含有所述sgRNA的质粒，将sgRNA序列构建到px458载体中，得到含有sgRNA的质粒。

含有所述sgRNA的T细胞，将含有sgRNA的质粒转染到T细胞中，得到含sgRNA的Crispr-PD1-T细胞。

所述Crispr-PD1-T细胞的制备方法如下：

步骤1、采集结肠癌患者外周血，分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗后，得到T细胞；收集的血浆经灭活、离心后，取上清，得到血浆上清。

步骤2、将T细胞加入KBM551培养基重悬细胞，使细胞密度保持在1×10⁶个/mL，添加γ干扰素浓度为200 IU/mL，放入培养箱培养。