[发明专利]一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA及含有该sgRNA的质粒、T细胞

权利要求书

1.一种具有高敲除率的人PD1基因sgRNA，其特征在于：所述sgRNA是敲除PD1基因的靶点；所述sgRNA的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示。

2.含有权利要求1所述sgRNA的质粒，其特征在于：将sgRNA序列构建到px458载体中，得到含有sgRNA的质粒。

3.含有权利要求1所述sgRNA的T细胞，其特征在于：将含有sgRNA的质粒转染到T细胞中，得到含sgRNA的Crispr-PD1-T细胞。

4.根据权利要求3所述的T细胞，其特征在于：所述Crispr-PD1-T细胞的制备方法如下：

步骤1、采集结肠癌患者外周血，分离出单个核细胞，将收集的单个核细胞用生理盐水清洗后，得到T细胞；收集的血浆经灭活、离心后，取上清，得到血浆上清；

步骤2、将T细胞加入KBM551培养基重悬细胞，使细胞密度保持在1×10⁶个/mL，添加γ干扰素浓度为200 IU/mL，放入培养箱培养；

步骤3、γ干扰素作用24h后，添加CD3/CD28单抗和IL-2，浓度分别为50ng/mL和300 IU/mL，培养48h后得到活化的T细胞；

步骤4、在6孔板中加入2mL/孔新鲜的含有300 IU/mL IL-2的KBM551培养基，置于37℃培养箱中预热，得到预热的培养基；收集活化的T细胞，取1.5×10⁷个细胞，用0.3mL电转液重悬，加入6μg含有sgRNA的质粒混合均匀，选择电活化T细胞程序电转，电转完成后将细胞立即转移至预热的培养基中，放回37℃培养箱中继续培养；

步骤5、48h后，取细胞进行流式检测，检测电转的效率；取样计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×10⁶个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，添加5Vol%的血浆上清；

步骤6、48h后进行细胞计数，根据计数结果补充相应的免疫细胞培养基和IL-2，使细胞的浓度维持在1×10⁶个/mL，IL-2的浓度维持在300IU/mL，补加5Vol%的血浆上清；

步骤7、48h后收集细胞，得到Crispr-PD1-T细胞。