[发明专利]一锅式核酸-抗体共检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种一锅式核酸抗体共检测方法及应用，涉及体外诊断领域。本发明通过设计制备特异性抗抗体‑寡核苷酸邻位延伸探针、多重PCR引物和Taqman探针，使用抗原预包被反应管捕获待测样品中的抗体，进行邻位延伸反应，最终通过反转录荧光定量PCR扩增技术，读取多重探针荧光强度，实现生物样品中核酸和抗体的同时检测，对于预测疾病的发生发展，提高临床诊断的准确率具有重大意义。

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，尤其涉及一种核酸和抗体共检测方法。

背景技术

蛋白质(抗原或抗体)和核酸(DNA或RNA)是体外诊断的两个主要目标类别，通常需要独立的平台，无法在单个平台上同时得到核酸和蛋白检测结果。

核酸检测涉及各种聚合酶链反应(PCR)策略，如经典PCR、实时PCR、多重PCR和数字PCR，可以检测低水平的核酸；蛋白质检测一般采用结合电场效应、纳米结构氧化锆、微流体、荧光、磁阻纳米线网、光纤、电化学等方法的生物传感器和夹心免疫分析，然而，这些方法由于缺乏信号放大设备导致检测灵敏度有限。

微流控技术由于芯片制备所用材料生物相容性不够好，可能会引起细胞功能发生改变。同时，由于芯片制备工艺复杂，对单细胞分离检测难以控制，大规模推广仍有较大困难。单细胞蛋白质印迹法(western blot)结合了聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的分子筛效应，该方法主要用于细胞裂解液中的痕量蛋白表达，但在生物样品中检测游离的痕量蛋白及与核酸共检测的应用目前未见报道。邻近结扎RNA测定(PLAYR)，需要结合流式细胞术和质量流式细胞术，有时可能无法找到靶标所对应的复合检测要求的抗体探针，限制了方法的应用。此外，该方法需要在大型质谱流式细胞分析仪上使用，本质上受到可用镧系金属标签数量的限制。目前大型质谱流式细胞分析仪和镧系金属标签均需从国外进口，货期长且价格昂贵。邻位连接技术(PLA)与核酸检测连用，由于T4连接酶在复杂生物样本(包括血清或血浆)中容易失去活性，影响反应效率，导致灵敏度降低，应用仍然受到限制。

综上所述，现有方法存在需要复杂而昂贵的仪器，分析时间长，灵敏度和定量分析能力有限，以及需要精通操作多个平台的熟练技术人员等缺陷。目前，尚未有技术可以在一台设备上同时检测血清中的抗体和核酸。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是在一台设备上同时对生物复合物样品中的蛋白质和核酸进行定量检测，以降低漏检率，提高检测效率。

为实现上述目的，本发明提供了一种一锅式核酸-抗体共检测方法，包括以下步骤：

步骤1、设计制备特异性抗抗体-寡核苷酸邻位延伸探针、多重PCR引物和Taqman探针；

步骤2、使用抗原预包被反应管；

步骤3、在上述反应管中加入待测生物样品稀释液；

步骤4、将特异性抗抗体-寡核苷酸探针加入洗涤后的反应管；

步骤5、在反应管中加入延伸体系，进行邻位延伸反应；

步骤6、提取样品RNA,加入反应管中，进行反转录荧光定量PCR，读取多重探针荧光强度，实现对待测样品中目标核酸-抗体的定量分析。

步骤1所述特异性抗抗体-寡核苷酸邻位延伸探针包括与待测样品中抗体结合的抗抗体和与抗抗体3'端连接的寡核苷酸序列。

所述寡核苷酸序列包括与5'连接探针相对应的碱基和PCR中使用的引物的结合位点。

所述探针为多重Taqman探针，分别标记波段不重叠的荧光基团。

所述步骤2具体操作如下：

步骤2.1、将PCR管用25微升8％戊二醛溶液在37℃处理5小时，使用包被缓冲液稀释抗原，取稀释后抗原加入到处理后的PCR管中，4℃下孵育过夜；