[发明专利]一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法

说明书

本发明属于生物制药领域，涉及一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法。该方法包括：收集血样，使用低速离心的方法去除血浆；加入淋巴细胞分离液Ficoll‑Hypaque上，1800‑2200rpm/min离心15‑25min；吸取单个核细胞层液体，洗涤，去除血小板和分离介质；至少提前1天用CD3抗体和/或CD28抗体预先包被细胞培养容器，置于4℃过夜，PBS清洗；用CIK初始培养基重悬获得的外周血单个核细胞，细胞培养箱中培养；次日加入IL‑2，放回培养箱继续培养，维持细胞浓度在0.5~1×10⁶细胞/ml。本发明的方法可获得大量CIK，获得的CIK细胞具有免疫特异性杀伤活性。

技术领域

本发明属于生物制药领域， 涉及一种细胞因子诱导的杀伤（CIK）的分离和扩增方法。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer，CIK）是一种非MHC限制性的高效杀伤活性的细胞毒性T细胞。

Lanier于1986年首次发现这种细胞（CD^{3 +} CD^{56 +} 细胞），其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%，经大量扩增具有杀伤肿瘤和抗病毒活性，是目前最新、最好的免疫治疗方法，它比以往的TIL细胞、NK细胞、LAK细胞等回输手段具有明显的治疗优势。CIK能够显著刺激初始型T细胞增殖，在机体的细胞免疫和体液免疫中起重要的调控作用。由于CIK细胞具有非MHC限制性, 高增殖活性, 高细胞毒力, 细胞来源丰富等优点, 目前已经广泛用于治疗恶性肿瘤。

DC-CIK，我们称之为靶向性CIK技术，是在体外将单核细胞用IFN-α、IL-2等细胞因子诱导和扩增为CIK后，再与用GM-CSF、IL-4等细胞因子诱导的具有极强抗原呈递功能的树突状细胞（dendritic cell DC）共培养，并加入肿瘤特异性抗原，之后回输体内达到特异性杀伤肿瘤的方法。DC通过识别和捕获肿瘤特异性抗原，不仅可以刺激T细胞的增殖，还会将肿瘤的抗原信息以MHC-抗原的形式传递给T细胞，使T细胞激活成为具有靶向性的杀伤细胞CTL，同时可以分泌大量细胞因子。这些细胞因子中，其中IL-2、IL-12、IFN-γ等可以诱导CIK成熟，并具有抗肿瘤的作用；IL-2、IL-6、TNF-α及GM-CSF等细胞因子，可增强细胞毒作用。

鉴于细胞因子诱导的杀伤细胞的优异性能，不论在科研或者实践应用中，CIK的大规模扩增都是重要的基础保障。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法，通过大规模的高效扩增细胞因子诱导的杀伤细胞，为细胞免疫治疗提供基础和可能性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，包括从血样中分离单个核细胞和进行扩增培养。

其中，分离单个核细胞依次包括以下步骤：

S1-1，收集血样，使用低速离心的方法去除血浆；

S1-2，淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上加入S1-1获得的产物，1800-2200rpm /min，离心15-25min；

S1-3，吸取单个核细胞层液体，洗涤，去除血小板和分离介质，得到外周血单个核细胞（PBMC）。

单个核细胞的细胞培养包括以下步骤：

S2-1，至少提前1天用CD3抗体和/或CD28抗体预先包被细胞培养容器，置于4℃过夜，PBS清洗；

S2-2，在S2-1步骤处理的细胞培养容器中，用CIK初始培养基重悬S1-3步骤获得的外周血单个核细胞，细胞培养箱中培养；

S2-3次日加入IL-2，放回培养箱继续培养，维持细胞浓度在0.5~1×10⁶细胞/ml。