[发明专利]一种细胞因子诱导的杀伤细胞的分离和扩增方法

权利要求书

1.一种细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，包括从血样中分离单个核细胞和单个核细胞的扩增培养；

分离单个核细胞依次包括以下步骤：

S1-1，收集血样，使用低速离心的方法去除血浆；

S1-2，淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上加入S1-1获得的产物，以1800-2200rpm的速度离心15-25min；

S1-3，吸取单个核细胞层液体，洗涤，去除血小板和分离介质，得到外周血单个核细胞（PBMC）；

单个核细胞的扩增培养包括以下步骤：

S2-1，至少提前1天用CD3抗体和/或CD28抗体预先包被细胞培养容器，置于4℃过夜，PBS清洗；

S2-2，在S2-1步骤处理的细胞培养容器中，用CIK初始培养基重悬S1-3步骤获得的外周血单个核细胞，细胞培养箱中培养；

S2-3，次日加入IL-2，放回培养箱继续培养，维持细胞浓度在（0.5~1）×10⁶细胞/ml。

2.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于, 所述的淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque上加入S1-1获得的产物，是将离心管倾斜30°~60°，在Ficoll液面以上至少1cm处缓慢加入去除血浆的血样，不打乱液面界面。

3.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于,步骤S1-2中，离心的条件为：加速度为最低，减速过程设定为无闸减速，速度2000 rpm /min；或者

离心后液体的分层，从上到下依次为：血清、单核细胞、分离液、粒细胞、红细胞。

4.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2-1中，CD3抗体和/或CD28抗体吸附在磁性纳米微球上；或者

所述的细胞培养容器是容积为细胞培养板、细胞培养皿或者25-1000mL的细胞培养瓶。

5.根据权利要求1所述的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法，其特征在于，

步骤S2-2中，用CIK初始培养基重悬S1-3步骤获得的外周血单个核细胞时，细胞初始浓度为（1-3）×10⁶细胞/ml；或者，

所述加入IL-2为1000U。