[发明专利]一种谷氨酸脱羧酶突变体

说明书

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体SEQ ID NO:3，其能高效催化L‑谷氨酸生成γ‑氨基丁酸，在pH4.0～7.0范围内具有高稳定性。以枯草芽孢杆菌为宿主过表达该谷氨酸脱羧酶突变体并制备固定化酶，添加300g/L的谷氨酸钠为底物，γ‑氨基丁酸的得率高达85％。

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在γ-氨基丁酸合成中的应用。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，是哺乳动物的中枢神经系统中重要的抑制性神经传递物，具有镇定、抗焦虑、抗癫痫、促进睡眠、改善更年期或老年精神障碍、增强肝肾功能、降血压、高效减肥、促进酒精代谢等功能，于2009年被国家卫生部批准为新资源食品，在医药、保健、种植业、饲料、化工、食品等行业具有广泛应用。

GABA的生产方法主要有直接提取法、化学合成法或生物合成法。直接提取法是从植物组织中直接提取GABA，但组织内的GABA含量较低，一般在0.3-32.5μmol/g范围内，因此该方法难以实现工业化应用(蒋振晖等,植物生理学通讯,2003,39(3):249-254)。化学合成法是当下最常使用的工业生产方法之一，一般利用γ-氯丁氰或者吡咯烷酮为原料合成GABA(林亲录等,现代食品科技,2008,5:496-500)，但反应过程条件要求苛刻、危险系数高、副反应较多，导致生产成本高，且成品由于化学杂质存在而难以用于食品、医药等行业。生物合成法包括微生物发酵法和酶催化法，是利用谷氨酸脱羧酶催化底物L-谷氨酸裂解为γ-氨基丁酸和CO₂，具有条件温和、转化率高、安全性高、产量高等优点，也是目前GABA生产的主要方法之一。

生产GABA常用的微生物有大肠杆菌、酿酒酵母、红曲霉、乳酸菌等。赵景联用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，可将1％谷氨酸底物完全转化为GABA(赵景联,生物工程学报,1989,2:124-128)。专利文献CN106967616A公开了从酒曲中筛选获得的米根霉(Rhizopus oryzae)，在含有0.5％谷氨酸钠的发酵培养基中培养5天后，GABA的含量达到1.08mg/g。专利文献CN107475151A公开了一株副短乳酸杆菌(Lactobacillusparabrevis)HX12-19，采用传统发酵和生物转化分段控制，GABA产量可以达到235g/L。专利文献CN112899260A公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体，热稳定性和结构稳定性得到提高，且在更宽的pH值范围内能够保持较高的活性，但采用全细胞形式进行催化需加热提高细胞膜通透性，对酶的热稳定性要求较高，且所用的宿主大肠杆菌因含有内毒素、普通消费者一般将大肠肝菌视为致病性细菌而产生心理排斥等问题，导致获得的GABA产品难以用于医药、食品等行业。

发明内容

为了开发一种具有生物安全性、高效的GABA生物转化方法，发明人对于众多微生物来源的谷氨酸脱羧酶进行了筛选，筛选出一种能够高效催化L-谷氨酸裂解反应的谷氨酸脱羧酶，其为来源于大肠杆菌E.coli的谷氨酸脱羧酶(EcGAD1，GenBank:CP053601.1)；为了进一步提高其酶活力和温度适应性，还尝试着对其进行突变改造，以及表达系统的优化，所得到的谷氨酸脱羧酶突变体在pH值中性条件下的稳定性显著提高。具体地，本发明包含如下技术方案：

一种谷氨酸脱羧酶突变体，其为野生谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1氨基酸序列中下述位点的一个以上、优选两个以上、更优选三个以上、更优选四个以上发生突变后所形成的突变体：第46位的异亮氨酸I46、第79位的精氨酸S79、第189位的甲硫氨酸突变为亮氨酸M189、第245位的丙氨酸A245、第299位的亮氨酸L299、第305位的酪氨酸Y305、第442位的谷氨酸K442，该谷氨酸脱羧酶突变体与SEQ ID NO:1氨基酸序列有98％以上、优选99％以上同源性、具有谷氨酸脱羧酶SEQ ID NO:1的功能，优选是催化L-谷氨酸裂解反应生成γ-氨基丁酸的功能、但具有更高的酶活力。

上述的术语“突变”包括但不限于氨基酸的取代、缺失或添加。