[发明专利]核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用

说明书

本发明公开了一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，具体包括步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，构建慢病毒载体；步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；步骤3)、体内慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预。本发明将LBR(核膜蛋白)用于抑制干细胞的分裂，促进干细胞的分化；神经干细胞移植后会可能存在较强的分裂能力，存在潜在致癌性。核膜蛋白敲降后，细胞分裂能力显著降低，因此该方法可广泛用于干细胞移植带来的致癌性问题。

技术领域

本发明涉及核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，属于干细胞移植领域。

背景技术

干细胞移植已成为再生领域的重要议题，然而其存在明显的致癌风险。常见的手段包括(i)化学治疗，(ii)基因治疗，和(iii)免疫治疗。免疫治疗存在高成本、批次之间的差异、非特异性抗体结合，和副作用大等缺陷。化学小分子的治疗则效率相对低下，目前难以满足临床的需求。基因治疗通常针对重编程转录因子，然而对重编程因子进行改造，容易导致细胞状态发生严重损害，不利于干细胞分化。

中枢神经系统损伤后，除原发性机械损伤直接造成的神经元死亡外，继发性损伤也会导致神经元持续性的凋亡、坏死，由此出现不同程度的轴突缺失及功能障碍。另一方面，成年哺乳动物的脊髓区域干细胞数量有限，且损伤后主要向胶质细胞而非神经元转化。因此，在哺乳动物受损区域补充新生神经元及修复上下行神经通路，对神经损伤修复具有重要意义。常见的方法是外源干细胞的移植使其在体内分化为神经元。但神经干细胞的增殖能力较强，存在严重的致癌风险，目前对其调控手段仍极为有限。

发明内容

本发明提供了一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，将LBR(核膜蛋白)用于抑制干细胞分裂，促进其分化，可广泛用于干细胞移植带来的致癌性问题。

本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案：

一种核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用，包括以下步骤：

步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，引物序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，构建慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；

步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；

21)神经干细胞的获取及传代：取分离的大鼠神经干细胞在培养基中进行传代，原代培养物生长5天，神经干细胞每4天传代一次，取第2-4代的神经干细胞用于所有实验；

22)取步骤1)所构建的慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分别对步骤21)获取的第2-4代的神经干细胞进行转染；12小时后加入500μl完全培养基；病毒转染后72小时，检测神经干细胞中的GFP表达以确定病毒滴度；

步骤3)、体内慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；

31)在小鼠脊髓损伤后1-2周分别注射步骤22)经病毒转染后的神经干细胞10万-100万个；

32)在神经干细胞体内移植后的2-8周内，利用慢病毒介导的核膜蛋白敲降，即通过微量注射泵进行慢病毒载体的注射，注射浓度为10⁶-10⁸/μL，注射体积为0.5μL-4μL；

33)损伤后6周对小鼠灌流固定，取相应脊髓节段，30μm连续切片，每个样品随机取3张切片进行免疫组化，对神经干细胞的分裂分化进行鉴定。

进一步的，所述步骤1)包括以下步骤：

11)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA引物，引物序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，并合成相关引物；