[发明专利]核膜蛋白敲降在干细胞移植方面的应用

权利要求书

1.一种核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，构建慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2；

步骤2)、体外慢病毒介导的核膜蛋白敲降对神经干细胞增殖分化进行干预；

21)神经干细胞的获取及传代：取分离的大鼠神经干细胞在培养基中进行传代，原代培养物生长5天，神经干细胞每4天传代一次，取第2-4代的神经干细胞用于所有实验；

22)取步骤1)所构建的慢病毒载体lbr-shRNAi-1和lbr-shRNAi-2，其MOI＝10，分别对步骤21)获取的第2-4代的神经干细胞进行转染；12小时后加入500μL完全培养基；病毒转染后72小时，检测神经干细胞中的GFP表达以确定病毒滴度；

所述步骤1)包括以下步骤：

11)、在线设计2对针对核膜蛋白的siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示；

12)、正反义寡核苷酸链退火；按以下体系配制退火反应体系：

1μg/μL正义寡核苷酸链5μL；

1μg/μL反义寡核苷酸链5μL；

ddH₂O 15μL；

反应条件：95℃，反应5分钟，后缓慢降至室温，得到退火后的寡核苷酸双链；

其中，lbr-shRNAi-1的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.3所示；对应的反义寡核苷酸链SEQ ID No.4所示；

lbr-shRNAi-2的正义寡核苷酸链如SEQ ID No.5所示；对应的反义寡核苷酸链SEQ IDNo.6所示；

13)、用AgeI和EcoRI双酶切线性化质粒GV112，得到改造后的线性化载体；酶切体系是：

反应条件：37度3小时；

14)、连接步骤12)退火形成的寡核苷酸双链与步骤13)所得改造后的线性化载体，得到重组质粒；按照以下体系配制连接反应体系：

反应条件：4℃过夜；

15)、转化及鉴定

将步骤14)连接所得的重组质粒导入感受态的大肠杆菌体内，以从含有抗生素的LB平板上挑取单菌落，进行测序；

16)、将上述连接重组的质粒和包装辅助质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0，转染到293T细胞中产生复制缺陷型慢病毒；收集上清液，并离心浓缩，纯化得到慢病毒载体；通过测量共表达的GFP确定病毒滴度。

2.根据权利要求1所述核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，所述步骤15)中鉴定包括以下步骤：

151)配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心；

ddH₂O 9.2μL；

2×Taq Plus Master Mix 10μL；

上游引物：10μM，0.4μL；序列如SEQ ID No.7所示；

下游引物：10μM，0.4μL；序列如SEQ ID No.8所示；

152)在超净工作台中，用无菌的枪头挑单个菌落至20μL至鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应，反应体系共20μL；

153)将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序，测序引物如SEQ ID No.8所示；若测序结果含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2则成功。

3.根据权利要求1所述核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，所述步骤21)中培养基包括：DMEM/F12、1X B27、1X PS、20ng/mL EGF和20ng/mLbFGF。

4.根据权利要求1所述核膜蛋白敲降在体外对神经干细胞增殖分化进行干预的应用，其特征在于，所述步骤22)中完全培养基包括：DMEM/F12、1X B27、1XPS、50ng/ml EGF和50ng/ml bFGF。