[发明专利]一种基于镧系纳米粒子的新型冠状病毒多组分核酸检测方法

权利要求书

1.一种基于镧系纳米粒子的新型冠状病毒多组分核酸检测方法，其特征是按照以下操作步骤进行：

a.制备羧基功能化的镧系纳米粒子：

a1为了合成 NaLnF4 (Ln=Tb, Ho, Eu) 纳米粒子，首先将 1 mmol NaF 溶解在 16 mL（Tb，Eu）/8 mL（Ho）H2O 中；同时，将1mmol LnCl₃·6H₂O溶解在24 mL（Tb，Eu）/32 mL（Ho）乙二醇中，在反应釜中形成镧系元素储备溶液；

a2向该均质储备溶液中加入 1.8 g 聚丙烯酸PAA（Mw=2000）并搅拌溶解；然后滴加NaF溶液，透明溶液变白而混浊；继续反应 60 分钟后，将液体转移到 100 mL 的高压釜中，填充度约为 40%，将反应釜放入烘箱中，200℃反应4小时；

a3反应结束后，取出反应釜，自然冷却至室温；然后将溶液转移到离心管中，弃掉上层液体，将沉淀用乙醇和水各洗3次，沉淀重新溶解于10mL水中均匀分散，便于后续实验操作；

b．制备镧系纳米粒子-DNA的核酸信号报告探针

b1 将 60L NaLnF4 -PAA 与 0.02g EDC 和 0.02g NHS 在 500μL MES 缓冲液中缓慢震荡 1 小时以活化羧酸（-COOH）基团；离心并重新溶解在 500μL HEPES 缓冲溶液中，然后将活化后的纳米粒子与1个OD的氨基（-NH₂）修饰的探针 DNA 在室温下孵育12小时过夜反应，然后离心和洗涤以获得 DNA 功能化的 NaLnF₄ NPs；

c.生物素化的捕获DNA探针和链霉亲和素修饰的磁性微球（SA-MB）的复合

c1 对链霉亲和素修饰的磁性微球进行 RNA酶（RNase）灭活处理：对于 100 μL 的 10mg mL-1 SA-MB，用溶液 A 洗涤两次（溶液A: 100 mmol L^-1 NaOH ，50 mmol L^-1 NaCl），用溶液 B （溶液B: 100 mmol L^-1 NaCl）洗涤一次，然后用 BW 缓冲液（BW 缓冲液：10 mmolL^-1 Tris-HCl and 1 mmol L^-1 EDTA，2 mol L^-1 NaCl ）冲洗，然后再分散在 100 μL 的 BW 缓冲液中；

c2 将 100 μL SA-MB 与 330 μL的2 μmol L^-1 生物素修饰的捕获DNA Capture O、Capture R 和 Capture E 同时混合；将混合物在 37°C 下轻轻摇动孵育 1 小时，通过链霉亲和素和生物素之间的特异性结合将 DNA 固定在 SA-MB的表面，获得 MB-Capture DNA探针;

c3 在磁力架上将反应后的溶液磁性分离，析出上清液，MB-DNA 探针用 BW 缓冲液洗涤，并用 Tris-HCl 缓冲液洗涤 3 次，以去除多余的未反应 DNA；

d．DNA杂交反应

d1 三组分同时进行的RNA夹心杂交体系每样品使用7.5 μL capture DNA-MBs， 由于capture O/R/E-MB、目标O/R/E和probe DNA-NaLnF₄ NPs（O/R/E-Tb/Ho/Eu NPs）之间的特异性识别，以 MB 作为固相反应基质和分离平台三条核酸链形成了夹心状结构；

d2 反应达到完全程度后，使用 200μL 增强剂溶液从形成的结构中释放离子，用于ICPMS 定量；

使用增强液（b-NTA，TOPO）从纳米粒子中释放 Tb³⁺/Ho³⁺/Eu³⁺ 形成b-NTA-Tb³⁺/Ho³⁺/Eu³⁺-TOPO 复合物；

e．ICPMS测定

e1取50μL消解后的溶液稀释至8mL，并转移至EP管,

e2 在ICPMS中进行 ¹⁵³Eu/¹⁵⁹Tb/¹⁶⁵Ho 元素的定量检测，使用仪器标准STD模式,

e3 ¹⁵³Eu/¹⁵⁹Tb/¹⁶⁵Ho的信号强度为标准，对所测得强度代入线性方程计算浓度。