[发明专利]纳米脂肪提取物的制备方法及应用

说明书

本发明公开了纳米脂肪提取物的制备方法及用于，制备方法具体包括1）脂肪组织的提取；2）脂肪组织破碎；3）脂肪组织消化离心；4）纳米脂肪获取；5）提取纳米脂肪细胞的旁分泌物质。本发明利用纳米脂肪细胞旁分泌的作用机制，收集提取了纳米脂肪细胞的旁分泌物质，并应用于膝骨关节炎的治疗研究，结果证明，纳米脂肪提取物能发挥和脂肪干细胞一样的效果，对于膝骨关节炎具有较好的治疗效果。

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种纳米脂肪提取物的制备方法及应用。

背景技术

纳米脂肪（nanofat）是从脂肪组织中获取的细胞混合物，主要由间充质干细胞、内皮祖细胞、基质细胞和免疫细胞组成。纳米脂肪被广泛应用于再生医学领域，发挥促进组织再生的作用，它主要通过里面所含的脂肪干细胞发挥作用。MSCs是从成人组织中分离出来的一类广泛的成体多能性基质细胞，具有自我更新能力、多系分化潜能、旁分泌效应和免疫调节特性。然而，MSCs的临床应用引起了伦理上的担忧，因为MSCs体外扩增可能导致遗传和表观遗传改变。此外，体外间充质干细胞扩增耗时较长，存在延迟治疗的潜在临床风险。与MSCs和其它细胞疗法相比，纳米脂肪可以直接从脂肪组织中获得，操作简便，且无需进行隔夜培养，使其相对于MSCs更安全、限制更少；纳米脂肪中不同类型的细胞在免疫调节、抗炎、血管生成等方面具有协同作用，其疗效可能优于单细胞治疗；纳米脂肪的归巢效应强于MSCs，因为培养扩张导致了归巢特性的丧失，这主要介导了MSCs的再生机制。然而，在临床应用过程中，纳米脂肪中的脂肪干细胞会随着时间推移而丧失活性，很难长期保持活性，因此疗效受到很大影响。纳米脂肪含有各种类型的细胞，许多可溶性因子可以被分泌，可能导致旁分泌结果。因此，为解决该问题，本发明利用纳米脂肪细胞旁分泌的作用机制，收集提取了纳米脂肪细胞的旁分泌物质，并应用于膝骨关节炎的治疗研究。

发明内容

针对现有技术中存在的纳米脂肪中的脂肪干细胞会随着时间推移而丧失活性，很难长期保持活性从而导致治疗效果差的问题，本发明设计的目的在于一种纳米脂肪提取物的制备方法，本发明的另一目的在于提供一种纳米脂肪提取物在治疗膝骨关节炎上的应用。

本发明通过以下技术方案加以实现：

所述的纳米脂肪提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将3周龄SD大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射进行麻醉，然后处死，置于75%酒精中，拿入细胞房，于无菌条件下，分离其腹股沟部位的脂肪组织，将取下来的脂肪组织放在含有双抗的PBS的培养皿中，将培养皿移入超净台进行下一步操作；

2）在超净台内对脂肪组织进行进一步清洗，分离，去除肌肉和筋膜组织，用含双抗的PBS清洗3遍，最后将脂肪组织剪碎成肉糜状；

3）用PBS配置Ⅳ型胶原酶对脂肪组织进行消化，将步骤2）肉糜状的脂肪组织吸入到离心管中，加入配置好的Ⅳ型胶原酶后用封口膜将离心管密封，置于恒温摇床上消化；

4）消化完毕后，将离心管在室温下离心，离心结束后，去除上清，加入PBS重悬沉淀，然后用100μm的细胞筛进行过滤，最后对过滤下来的溶液离心，得到的即是纳米脂肪；

5）将步骤4）得到的纳米脂肪接种到10cm的培养皿中，培养基为α-MEM培养基，培养48h后，收集上清进行离心除去细胞碎片，再用0.22μm过滤器进行无菌过滤，获得Nanofat-CM，即纳米脂肪细胞的旁分泌物质，储存于-80℃备用。

进一步地，步骤1）中PBS中添加有1%的青霉素-链霉素双抗混合液。

进一步地，步骤3）中Ⅳ型胶原酶的浓度为0.2%，添加量为超过脂肪组织2-3ml为宜，消化条件为，温度37℃，转速400rpm，消化时间30min。

进一步地，步骤4）中离心时间为5分钟，离心转速为1000rpm/min。

进一步地，步骤5）中纳米脂肪的接种密度为1x10⁶个/皿，所述α-MEM培养基中含有10%FBS，离心时间为10min，离心转速为1500rpm/min。