[发明专利]纳米脂肪提取物的制备方法及应用

权利要求书

1.纳米脂肪提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将3周龄SD大鼠用3%戊巴比妥腹腔注射进行麻醉，然后处死，置于75%酒精中，拿入细胞房，于无菌条件下，分离其腹股沟部位的脂肪组织，将取下来的脂肪组织放在含有双抗的PBS的培养皿中，将培养皿移入超净台进行下一步操作；

2）在超净台内对脂肪组织进行进一步清洗，分离，去除肌肉和筋膜组织，用含双抗的PBS清洗3遍，最后将脂肪组织剪碎成肉糜状；

3）用PBS配置Ⅳ型胶原酶对脂肪组织进行消化，将步骤2）肉糜状的脂肪组织吸入到离心管中，加入配置好的Ⅳ型胶原酶后用封口膜将离心管密封，置于恒温摇床上消化；

4）消化完毕后，将离心管在室温下离心，离心结束后，去除上清，加入PBS重悬沉淀，然后用100μm的细胞筛进行过滤，最后对过滤下来的溶液离心，得到的即是纳米脂肪；

5）将步骤4）得到的纳米脂肪接种到10cm的培养皿中，培养基为α-MEM培养基，培养48h后，收集上清进行离心除去细胞碎片，再用0.22μm过滤器进行无菌过滤，获得Nanofat-CM，即纳米脂肪细胞的旁分泌物质，储存于-80℃备用。

2.如权利要求1所述的纳米脂肪提取物的制备方法，其特征在于步骤1）中PBS中添加有1%的青霉素-链霉素双抗混合液。

3.如权利要求1所述的纳米脂肪提取物的制备方法，其特征在于步骤3）中Ⅳ型胶原酶的浓度为0.2%，添加量为超过脂肪组织2-3ml为宜，消化条件为，温度37℃，转速400rpm，消化时间30min。

4.如权利要求1所述的纳米脂肪提取物的制备方法，其特征在于步骤4）中离心时间为5分钟，离心转速为1000rpm/min。

5.如权利要求1所述的纳米脂肪提取物的制备方法，其特征在于步骤5）中纳米脂肪的接种密度为1x10⁶个/皿，所述α-MEM培养基中含有10%FBS，离心时间为10min，离心转速为1500rpm/min。

6.利用权利要求1-5任一方法得到的纳米脂肪提取物在制备治疗膝骨关节炎药物中的应用。