[发明专利]猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及生物疫苗领域，尤其是一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用，制备单克隆抗体所用的免疫原为猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒；猪圆环病毒4型Cap蛋白包括3个核心抗原表位，分别为表位1：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST；表位2：NAYYRIRKIKVEFLPLI；表位3：SIQNSNFVQVWTVRFTL。本发明制备了猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，建立了以6D5单抗为捕获抗体的PCV4Cap蛋白VLP的单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法，具有敏感性高、特异性强、稳定性好、高通量等优点。

技术领域

本发明涉及生物疫苗技术领域，具体领域为一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，以及利用该抗体建立的可用于抗原定量的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是一种非包膜环状DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。PCV是一种最小的DNA动物病毒，基因组大约是1.7kb。自从20世纪70年代发现PCV1以来，已发现的PCV主要是PCV1、PCV2和PCV3三种。基于基因序列和抗原性差异，PCV1已被鉴定为一种肾细胞污染物，不会导致猪的临床疾病。PCV2和PCV3感染会导致猪多种疾病、且在全球分布。PCV2是一种可引起多种疾病主要的致病病原，如仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，猪皮炎和肾病综合征(PNDS)，繁殖障碍和先天性震颤，严重危害养猪业。截至2019年，只有PCV1、PCV2和PCV33种圆环病毒属于已知猪的圆环病毒科。PCV3也与多种疾病密切相关，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎和肾炎综合征、心肌炎、呼吸道综合征以及神经性疾病等。2019年，PCV4在中国被首次鉴定为一种新型圆环病毒。2019年4月，在湖南出现严重临床症状(呼吸道、肠炎症状和PDNS)的猪身上鉴定出一种新型CV，与其它CV相关性差别较大。病毒基因组大小为1770个核苷酸(nt)，经鉴定为猪圆环病毒4型(PCV4)。

PCV4的基因序列与貂圆环病毒的同源性最高(66.9％)，与猪其他圆环病毒的基因组同源性为43.2％～51.5％。PCV4基因组包含12个开放阅读框(ORF)，预测的两个主要基因包括，一个复制酶(rep)基因(891nt)，编码一种由296个氨基酸组成的蛋白质，和一个衣壳(cap)基因(687nt)，编码一种由228个氨基酸组成的蛋白质。

尝试用PK-15和ST细胞系分离PCV4，都没有成功，而PCV2可以用上述细胞培养方法分离，说明PCV4的生物学特性有别于PCV2。未来可能需要采用细胞工程技术建立对PCV4更敏感的细胞系，或通过培养条件的优化促进PCV4的体外培养。PCVs一般来说很难在体外生长，如PCV2复制非常缓慢，需要添加葡萄糖胺，对于PCV3来说，感染性克隆也是直到2019年才成功构建并用于致病性研究。

目前针对PCV4的流行病学调查技术主要是PCR技术，以实时荧光定量PCR最为常用。采用一种基于SYBR Green的实时荧光定量PCR方法进行PCV4临床样本分析，显示PCV4的阳性检出率为10.71％(18/168)。采用TaqMan实时荧光定量PCR检测，结果显示湖南省PCV4流行率为12.8％。阳性率最高的是鼻拭子(28.5％)和血清样本(13.4％)，表明PCV4在该地区猪群中具有中等感染率。目前，PCV1和PCV2的致病性都已经很明确，PCV3感染的临床表现多样，甚至在无明显临床症状的猪群中也有检出，PCV4在发病猪群和健康猪群均有检出。

由于PCV4属于新发病原，加上PCV4感染导致的复杂临床现象，未来猪圆环病毒的诊断和疫苗研发更为复杂，而PCV4尚不能在细胞中进行培养，体外难以获得纯病原培养物，当务之急是研制更为精确、全面的血清学检测和抗原检测方法及抗原定量方法。

由于目前尚无针对PCV4的血清学诊断试剂及相应的方法，急需一种有效的血清学诊断技术。未来的疫苗研发也一定需要抗原定量方法，因此，本发明制备了猪圆环病毒4型(PCV4)Cap蛋白单克隆抗体，并建立了可用于PCV4 Cap蛋白VLP抗原定量的单分子成像酶联免疫吸附试验(iELISA)方法。