[发明专利]猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：制备所述单克隆抗体所用的免疫原为猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒；

所述猪圆环病毒4型Cap蛋白包括3个核心抗原表位，分别为表位1：RRRSRWRRKNGIFHARFMREVTLSVSSFST，如SEQ ID NO：3所示；表位2：NAYYRIRKIKVEFLPLI，如SEQ ID NO：4所示；表位3：SIQNSNFVQVWTVRFTL，如SEQ ID NO：5所示。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体的免疫球蛋白类型包括单克隆抗体3E6、4A7和6D5；其中，单克隆抗体3E6为IgG2b亚型，单克隆抗体4A7和6D5均为IgG1亚型，轻链类型均为κ。

3.根据权利要求2所述的猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体，其特征在于：单克隆抗体6D5的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

4.权利要求1-3任一所述猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)免疫程序

将纯化的猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒与等体积的弗氏完全佐剂乳化，对6～8周龄BALB/c小鼠进行腹腔多点注射，免疫剂量100μg/只；14d后将纯化的猪圆环病毒4型Cap蛋白形成的病毒样颗粒蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后进行免疫；细胞融合前3d加强免疫，腹腔注射500μg纯化的重组猪圆环病毒4型Cap蛋白；

(2)杂交瘤细胞融合

采用PEG1450将SP2/0细胞与脾细胞进行融合，按1：5～1：2比例取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞混合，离心后弃上清；缓慢加入50％PEG1400进行融合；用1％的HAT选择培养基重悬融合细胞，加至96孔细胞培养板中，置37℃、5％CO₂培养箱培养，每天观察细胞生长情况；采用间接ELISA方法进行MAb筛选，选取仅与猪圆环病毒4型Cap蛋白呈阳性反应的杂交瘤细胞进行细胞克隆纯化；

(3)单克隆抗体腹水的制备

取10周龄健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡0.5mL/只，7～14d后腹腔注射0.5mL杂交瘤细胞5×10⁵～1×10⁶个/只，待小鼠腹部明显增大时抽取腹水，离心去除油脂和沉淀后即为单克隆抗体腹水。

5.权利要求1-3任一所述猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒定量中的应用，其特征在于：基于单克隆抗体6D5，建立单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法，用于定量检测目的蛋白质。

6.根据权利要求5所述的猪圆环病毒4型Cap蛋白单克隆抗体在PCV4病毒样颗粒定量中的应用，其特征在于，单分子成像酶联免疫吸附试验iELISA方法的核心溶液的使用方法为：(1)链霉亲和素溶液工作浓度为0.1-0.3mg/mL；(2)生物素化的山羊抗鼠二级抗体溶液工作浓度为20-30ng/mL；(3)抗PCV4 Cap蛋白VLP的小鼠单克隆抗体6D5单抗溶液工作浓度为10-30ng/mL；(4)兔抗PCV4 Cap蛋白VLP的多克隆抗体工作浓度为20-30ng/mL；(5)FITC标记的山羊抗兔二级抗体溶液工作浓度为0.5-2ng/mL。