[发明专利]一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的高产发酵方法

说明书

本发明公开了一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的高产发酵方法，属于生物工程技术领域，包括如下步骤：1)取‑80℃冻存的表达菌种，无菌操作条件下接种至种子培养基中，种子培养基为BMGY培养基或者为YPD培养基，种子培养使用500ml或者1L三刺三角摇瓶，装液量250ml～500ml，接种量0.5‰～1.5‰，接种后在摇床中30℃250rpm培养16～24小时至OD600达到6～10；本发明通过使用重组毕赤酵母菌在10L发酵罐中培养时经过60小时的诱导，培养基上清中表达的葡萄糖脱氢酶酶活达到1150000U/L(DCPIP比色法测定值),酶活得率提高了4.4～4.5倍，并且诱导时间仅需60小时，比现有技术所使用的诱导时间缩短了三分之一甚至近一半，解决了现有技术发酵时间长、酶活得率低、不利于大规模工业化放大生产的问题。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的高产发酵方法。

背景技术

葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase,GDH)属于GMC氧化还原酶(Glucosemethanol choline oxidoreductase)家族，它和辅基一起能够在NAD(P)+等存在的情况下催化β-D-葡萄糖形成D-葡萄糖酸-δ-内酯，D-葡萄糖酸-δ-内酯自发形成葡萄糖酸。葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化过程中不像葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOD)那样需要利用氧气作为电子受体，因而检测结果不会受到样品中溶氧的影响，所以在血糖检测、生物燃料电池、植入式心脏起搏器和工业葡萄糖含量监测等领域有着广泛的应用。葡萄糖脱氢酶根据其所结合的辅基不同可分为三种类型：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的葡萄糖脱氢酶(β-nicotinamide adenine dinucleotide-dependent GDH,NAD-GDH)、吡咯喹啉醌依赖的葡萄糖脱氢酶(pyrroloquinoline quinine-dependent GDH,PQQ-GDH)和黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的葡萄糖脱氢酶(flavin adenine dinucleotide-dependent GDH,FAD-GDH)。三种GDH中NAD-GDH的热稳定性较差，PQQ-GDH底物专一和热稳定性都比较差，影响了它们的应用，而FAD-GDH催化效率高、稳定性好、底物专一性好，已经越来越多的用于血糖试纸和葡萄糖生物传感器的生产。

中国专利(CN201810301960.X)公开了一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的生产、纯化方法，属于生物工程领域。本发明以大肠杆菌为宿主，表达来源于洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶，过分批补料，分阶段温度控制，进行葡萄糖脱氢酶表达。

目前，以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(即FAD-GDH，EC 1.1.99.10)主要来源于丝状真菌，目前为止已经发现和鉴定的FAD-GDH主要来自米曲霉、黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、碳黑曲霉、青霉和杉木炭疽病菌等，唯一一种原核来源的FAD-GDH来源于洋葱伯克氏细菌。FAD-GDH的重组表达比较困难，大部分的FAD-GDH主要从生产菌株中分离得到。大肠杆菌作为最简单方便和有效的表达宿主，在表达FAD-GDH时效果不佳，要么表达量很低要么形成包涵体，上清中检测到的酶活较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种发酵诱导时间短、酶活得率高、便于工业化放大生产的FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的高产发酵方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下方法：一种FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶的高产发酵方法，其包括如下步骤：

1)取-80℃冻存的表达菌种，无菌操作条件下接种至种子培养基中，种子培养基为BMGY培养基或者为YPD培养基，种子培养使用500ml或者1L三刺三角摇瓶，装液量250ml～500ml，接种量0.5‰～1.5‰，接种后在摇床中30℃250rpm培养16～24小时至OD600达到6～10；

2)10L发酵罐发酵需配制3.5L～4L发酵培养基，发酵培养基为BSM基础盐培养基，发酵培养基灭菌后使用28％氨水将pH值调至5.0～6.0；