[发明专利]巴尔通体探针RPA特异性引物组合物、检测试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种巴尔通体的RPA特异性引物对Ⅰ和引物对Ⅱ、检测试剂盒和检测方法，本发明所建立的探针重组酶聚合酶扩增技术诊断方法能有效检测虫媒传染病巴尔通体的特异性基因，其最低检测限质粒模板浓度达到10²copies/μl；各病原体间无交叉反应，特异性好；检测精密度小于5％，可重复性好。该技术能够实现虫媒传染病巴尔通体现场快速检测，丰富了虫媒传染病的检测手段，不仅可为现场检测提供技术手段，也为国境口岸疾病监测提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及一种巴尔通体探针RPA特异性引物组合物、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

现有口岸荧光定量PCR等检测技术对虫媒传染病的检测时间长，难以快速的发现虫媒传染病，像大型会场现场这种需要快速检测，确保运动员顺利参加赛事的场景，缺乏可快速得到检测结果的检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中缺少快速检测虫媒传染病的试剂盒的缺陷，提供一种基于重组酶聚合酶扩增的探针重组酶聚合酶扩增技术，应用于虫媒传染病巴尔通体的快速分子检测并研发成试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

重组酶聚合酶扩增技术包括3种关键组分，分别是重组酶(如 T4 uvsX、E.colirecA等)、单链结合蛋白(如T4 gp32等)和链置换DNA聚合酶(如B.subtilis Pol I、S.aureus Pol等)。

重组酶聚合酶扩增技术的原理，如下：

(1)重组酶与长约30-35nt的引物结合形成的复合物在双链DNA模板中寻找靶位点；

(2)复合物在模板上定位后可以直接引发链交换反应形成D-Loop结构，单链结合蛋白随即结合被置换的DNA链，稳定形成的D-Loop结构并且防止引物解离；

(3)重组酶-引物复合物主动水解体系中的ATP导致复合物构象改变，重组酶解离后引物3'端暴露并被DNA聚合酶识别，DNA聚合酶按照模板序列在引物3'末端添加相应碱基，DNA

扩增启动；

(4)链置换DNA聚合酶在延伸引物的同时继续解开模板的双螺旋DNA结构，DNA合成过程继续进行；

(5)两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子。

重组酶聚合酶扩增体系中还含有T4 uvsY和Carbowax20M等成分，可以改变重组酶-引物复合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更有利于重组酶聚合酶扩增的进行。同时，重组酶聚合酶扩增体系中可以加入反转录酶将RNA作为模板合成DNA后再进行扩增，使重组酶聚合酶扩增可以同时应用于RNA的检测。按照上述体系建立的重组酶聚合酶扩增反应体系一般称为基础型RPA方法。在基础型 RPA的基础上，Piepenburg等利用序列特异性荧光探针建立了可以实时监测荧光信号判断产物扩增情况的探针法RPA以及可以直接肉眼观察最终扩增结果的侧流层析试纸条RPA(lateral flow RPA， LF-RPA)。