[发明专利]一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒

说明书

本发明涉及毛霉菌检测技术领域，公开了一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒。该引物探针组包括引物组和探针组，所述引物组包括：用于检测米根霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于检测微小根毛霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；用于检测伞枝横梗霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本发明的引物探针组和试剂盒能实现米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉在种水平的同步检测，检测速度快，且检测特异性和准确度高。

技术领域

本发明涉及毛霉菌检测技术领域，即一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒。

背景技术

毛霉菌病是一种新兴的由毛霉菌丝状真菌引起的严重感染性疾病，其发展快速，死亡率高，主要影响免疫功能低下的患者和糖尿病患者。在真菌感染中，毛霉菌发病率占8.3％～13％，仅次于假丝酵母菌和曲霉菌。近年来，毛霉病在高危人群中的发病率上升，在恶性肿瘤及器官移植患者中约为1％。毛霉病的发病率在免疫缺陷患者常见深部真菌感染中占第二位。据报道，毛霉菌病在美国和法国的发病率在2000年至2010年期间每年增加约7％，而死亡率则每年增加9.3％。在西班牙，该疾病的发病率从2005年的0.62例/10万人增加到2007年至2015年的3.3例/10万人。毛霉病在发展中国家的检出也越来越频繁，特别是在印度、中国和拉丁美洲国家。在印度，它的发病率达14例/10万人。毛霉病感染进展迅速，大多病情凶险，180天内死亡率为56.7％，死亡率较高，且死亡时间大多在1月以内。毛霉病因为临床表现不典型，诊断较困难。经过文献统计，米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉属于临床感染毛霉病较多检出的几种毛霉菌。

毛霉病的常规检测方法有痰培养、病理活检、影像学检测。其中，痰培养检测的特异性差，且培养时间较长；影像学检测时，真菌感染病灶的形态缺乏特异性，会给诊断造成一定困难。毛霉菌的分子生物学检测主要包括核酸扩增检测技术，其中，多重qPCR技术能同步检测多种毛霉菌，缩短检测时间，但其对引物和探针的特异性要求较高，引物和探针的设计难度较大，非目标菌易对目标菌的扩增和检测产生干扰，目标菌之间也会存在相互干扰。受限于以上的条件，目前毛霉菌的分子生物学检测多局限在属水平，种水平的检测较为罕见。

专利CN112725508A公开了用于肺毛霉菌病致病菌检测的试剂盒及其使用方法和用途，该试剂盒包含能够以混合物形式存在的通用引物，其中，所述通用引物能够结合至米根霉、微小根毛霉、伞枝横梗霉、匍枝根霉和刺孢小克银汉霉菌的共有基因保守区。采用该试剂盒，虽然能够实现对多种毛霉真菌的一次性检测，但由于引物是针对于多种毛霉菌的共有基因保守区设计的，特异性较差，在检测过程中易受到非目标菌(特别是同属的非致病毛霉菌)的干扰。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组和试剂盒。本发明的引物探针组和试剂盒能实现米根霉、微小根毛霉和伞枝横梗霉在种水平的同步检测，检测速度快，且检测特异性和准确度高。

本发明的具体技术方案为：

一种用于检测致病毛霉菌的多重PCR引物探针组，包括引物组和探针组，所述引物组包括：用于检测米根霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；用于检测微小根毛霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示；用于检测伞枝横梗霉的上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。

作为优选，所述探针组包括：用于检测米根霉的探针，序列如SEQ ID NO.7所示；用于检测微小根毛霉的探针，序列分别如SEQ ID NO.8所示；用于检测伞枝横梗霉的探针，序列如SEQ ID NO.9所示。