[发明专利]海洋来源具有抗菌作用的土曲霉M7及其次级代谢产物的分离及应用

说明书

本发明属于微生物技术领域，涉及海洋来源具有抗菌作用的土曲霉M7及其次级代谢产物的分离及应用；该菌株的分类命名为土曲霉属（Aspergillus terreus）M7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2021679，保藏日期是2021年6月7日。以黄豆固体培养基对该菌株进行发酵，经甲醇浸提、硅胶G层析、Sephadex LH‑20凝胶柱层析、硅胶H层析、制备液相分离纯化，获得化合物terramide A。terramide A对鲍曼不动杆菌ATCC 19606具有明显的抗菌活性，具有开发为抗菌剂的潜力。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种可以作为抗菌剂的Aspergillus terreus的次级代谢产物提取、分离方法及用途。

背景技术

目前许多临床使用的抗生素大多来源于微生物的次级代谢产物或其衍生物。但随着对自然界微生物资源的不断开发，以发现新种属微生物来开发新抗生素的道路已经越来越艰难。临床抗生素的频繁使用又直接导致现有抗生素的耐药性不断增加。相比于陆地环境，海洋环境具有无光照、低营养、高压、高盐、低温的特点。由于海洋生存条件的苛刻，在其中生存的微生物，尤其是真菌，经过长期的自然选择已经进化出与陆地真菌相比更为复杂代谢系统。因此以海洋微生物为研究材料能使活性化合物的中靶几率大大提高。

曲霉属因其丰富的次级代谢产物而被广泛的研究。作为海洋环境中分布最广的丝状真菌，曲霉素真菌经过长期的进化而产生对海洋极端环境的适应。其中丰富多样的次级代谢产物正是这些曲霉属真菌能适应环境非常重要的一个原因。这些曲霉属真菌合成的次级代谢产物呈现出多种不同的结构类型，在各种结构类型中，聚酮类和生物碱类占到了主要部分，此外还有萜类、甾体、多肽、环肽、大环内脂、蒽醌等其他类型化合物。因此在实验室条件下，通过多种培养方法，能最大程度开发真菌产生有价值的次级代谢产物的能力。

发明内容

本发明的目的之一是提供提供一种该土曲霉发酵以及活性次级代谢产物分离的方法。

本发明的目的之二是提供海洋来源曲霉属真菌M7次级代谢产物在抑制鲍曼不动杆菌19606的作用。

本发明为了实现以上两个目的采用的技术方案如下：

一种土曲霉M7(Aspergillus terreus)，保藏于中国典型培养物中心，保藏地址中国，武汉，武汉大学，保藏时间2021年6月7日，保藏编号是CCTCC NO:M 2021679。

依据本发明的第一方面，提供土曲霉次级代谢产物的制备方法，具体方法如下：

(1)孢子制备：

将保存在-80℃超低温冰箱的土曲霉M7的甘油管接种在PDA平板上，置于28℃、黑暗培养3天。

(2)种子液制备：

在PDA平板上长出单菌落之后，用无菌接种环将孢子和菌丝刮至300ml PDB液体培养基中，200rpm，28℃，培养4天。

(3)菌株发酵

按照1ml种子液/10g培养基的比例将种子液接种到固体发酵培养基中，静置培养30天。

(4)次级代谢产物提取

按照10L/1kg的比例用乙醇浸泡固体发酵产物，超声浸提30分钟，减压抽滤得到浸提液。浸提三次。40℃减压旋蒸除去液体，按浸提液比乙酸乙酯1：1的比例萃取三次，将萃取后的乙酸乙酯40℃减压旋蒸后即可获得发酵浸膏。

(5)分离纯化

最终发酵浸膏依次经硅胶G层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、硅胶H层析、制备液相分离纯化，即可获得terramideA。