[发明专利]一种日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEAP2基因启动子及其应用

说明书

本发明涉及一种日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEP2基因启动子及其应用。本发明成功克隆了日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEP2基因启动子序列，并成功构建了日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEAP2基因启动子pGL3‑LEAP2‑pro荧光素酶报告质粒；实验证明日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEAP2基因启动子可被病毒模拟物polyI:C、革兰氏阴性菌重要表面抗原LPS以及嗜水气单胞菌诱导激活。本发明可为研究日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEAP2基因的表达调控机制、鱼类抵御病原菌感染的天然免疫应答机制、特别是重要的鱼类炎症相关NF‑κB和MAPK信号通路网络调控机制的研究提供良好的实验系统，为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造条件。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及日本鳗鲡肝脏表达抗菌肽LEP2基因启动子及其应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有生物活性的小分子多肽，是机体先天性免疫防御系统的重要组成部分，能够对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和寄生虫等均具有较好抑制或杀伤作用，在天然免疫应答反应中发挥重要作用[Chung,C.-R.,J.-H.Jhong,Z.Wang,W.Chen,Wan,Horng and T.-Y.Lee(2020).Characterizationand Identification of Natural Antimicrobial Peptides on Different Organisms.International Journal of Molecular Sciences 21:986.]。鱼类与哺乳动物等高等脊椎动物一样，具有先天性免疫和适应性免疫系统。抗菌肽作为鱼类先天性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能够迅速产生并在体内扩散以起到防御和杀伤作用。

鱼类抗菌肽主要由Cathelicidins、肝脏表达抗菌肽-2(LiverexpressedAntimicrobial Peptide 2,LEAP-2)、Piscidins、β-defensins、Hepcidins、以及NKlysins组成[齐志涛,徐杨,邹钧,聂品(2020).水产动物抗菌肽研究进展.水产学报44(09):1572-1583.]。肝脏表达抗菌肽是一种小分子阳离子蛋白，主要在肝脏中表达，具有四个高度保守的半胱氨酸形成两对二硫键，在杀灭细菌中起关键作用(Ma et al.2009)。已经在日本鳗鲡、金鲳鱼(Trachinotus ovatus)虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)、在斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、武昌鱼(Megalobrama amblycephala)、草鱼(Ctenopharyngodonidella)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、鲤鱼(Cyprinus carpio L.)等多种鱼类中被鉴定出来。

但有关鱼类肝脏表达抗菌肽启动子的研究仅在金鲳鱼中有所报道[Liu,B.,G.-D.Liu,H.-Y.Guo,K.-C.Zhu,L.Guo,N.Zhang,B.-S.Liu,S.-G.Jiang and D.-C.Zhang(2020).Characterization and functional analysis of liver-expressedantimicrobial peptide-2(LEAP-2)from golden pompano Trachinotus ovatus(Linnaeus 1758).FishShellfish Immunology 104:419-430；卵形鲳鲹两种抗菌肽基因功能及转录调控研究，硕士论文，刘广东，天津农学院2019，英文论文是硕士论文的一部分发表]，其内容仅涉及该启动子在人类细胞293细胞中的转录活性研究，而有关肝脏表达抗菌肽启动子是否在鱼类细胞具有转录活性、是否能够被病毒、细菌等病原微生物进行诱导表达的免疫调控的机制尚未见报道。

基因的表达调控已成为分子生物学研究领域的热点，启动子是基因表达调控的重要元件。鉴于鱼类LEAP2在抗细菌和病毒免疫及其病害防治中的重要性，研究其基因表达调控机制将为通过调节LEAP2的表达来防治鱼类细菌和病毒病提供新的思路。