[发明专利]一种日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子及其应用

说明书

本发明涉及一种日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子及其应用。本发明成功克隆了日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子序列，并成功构建了日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子pGL3‑Cathelicidin2‑pro荧光素酶报告质粒。实验证明日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子可被革兰氏阴性菌重要表面抗原LPS以及嗜水气单胞菌诱导激活。日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子的克隆及其强启动子活性的诱导表达分析，为研究日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因的表达调控机制、鱼类抵御病原菌感染的天然免疫应答机制、特别是重要的鱼类炎症相关NF‑κB和MAPK信号通路网络调控机制的研究提供良好的实验系统，为利用该启动子构建表达载体高效表达外源基因或将该启动子应用于转基因鱼构建创造条件。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及日本鳗鲡抗菌肽Cathelicidin2基因启动子及其应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一类具有生物活性的小分子多肽，是机体先天性免疫防御系统的重要组成部分，能够对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌、病毒和寄生虫等均具有较好抑制或杀伤作用，在天然免疫应答反应中发挥重要作用[Chung,C.-R.,J.-H.Jhong,Z.Wang,W.Chen,Wan,Horng and T.-Y.Lee(2020).Characterizationand Identification of Natural Antimicrobial Peptides on Different Organisms.International Journal of Molecular Sciences 21:986.]。鱼类与哺乳动物等高等脊椎动物一样，具有先天性免疫和适应性免疫系统。抗菌肽作为鱼类先天性免疫系统的重要组成部分，当鱼体受到损伤或病原微生物侵袭时，能够迅速产生并在体内扩散以起到防御和杀伤作用。鱼类抗菌肽主要由Cathelicidins、肝脏表达抗菌肽-2(LiverexpressedAntimicrobial Peptide 2,LEAP-2)、Piscidins、β-defensins、Hepcidins、以及NKlysins组成[齐志涛,徐杨,邹钧,聂品(2020).水产动物抗菌肽研究进展.水产学报44(09):1572-1583.]。

Cathelicidin是目前发现的一个最大抗菌肽家族，具有广谱抗病原微生物的作用，对革兰氏阳性菌、阴性菌、真菌、病毒和原生动物都有很好的杀灭效果。研究表明人类仅有一个Cathelicidin基因，而其他哺乳动物和鱼类含有多个Cathelicidin基因。鱼类Cathelicidin结构同哺乳动物一样，包括信号肽(Pre区域)、Pro区域以及C端成熟肽三个区域，但所含氨基酸数目有所不同。目前在日本鳗鲡、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)以及大西洋鲑(Salmo salar)、美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)鉴定出Cathelicidin1和Cathelicidin2两种抗菌肽，在香鱼(Plecoglossus altivelis)和茴鱼(Thymallusthymallus)鉴定出Cathelicidin2一种抗菌肽，而在大西洋鲟(Gadus morhua)鉴定出Cathelicidin1、Cathelicidin2、Cathelicidin3三种抗菌肽[张东玲，关瑞章(2013).鱼类Cathelicidin抗菌肽的研究进展.集美大学学报(自然科学版)18(06):413-419.]。但有关鱼类抗菌肽Cathelicidin2启动子的研究仅在虹鳟中有所报道[赵紫霞，许建，江炎亮，白庆利，蒋立坤，陈葆华，徐鹏(2018).虹鳟免疫诱导型基因Cathelicidin2启动子功能分析.渔业科学进展39(04):37-45.]。该研究成功构建了虹鳟pGL3-Cathelicidin2启动子荧光素酶表达载体，当且发现NF-κB转录因子能够增强该启动子活性，但其荧光素酶表达载体是否被病毒、细菌等病原微生物进行诱导表达的免疫调控的机制尚未见报道。