[发明专利]基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物对及其检测试剂盒

说明书

本发明公开了基于链交换扩增的miRNA‑208a扩增引物对及其检测试剂盒，所述扩增引物对包含正向引物和反向引物，正向引物由5’端侧平衡序列和3’端侧扩增序列组成，扩增序列与miRNA‑208a‑3p的5’端侧序列同源；反向引物由5’端侧扩增序列和3’端侧平衡序列组成，扩增序列与miRNA‑208a‑3p的3’端侧序列互补。本发明的miRNA‑208a等温扩增反应完成后加入运行缓冲液，混匀滴加到试纸条加样窗口，2分钟后检测荧光信号。本发明的检测方法可在1小时内完成。本发明miRNA‑208a检测方法操作简便，快速、安全，可为急性心肌梗死提供一种早期分子诊断检测方法。

技术领域

本发明涉及基于链交换扩增的miRNA-208a扩增引物及其检测试剂盒，属于分子生物学检测技术、侧流层析技术等技术领域。

背景技术

心血管疾病的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，极大地威胁着人民群众的生命与健康。我国现有心血管疾病患者人数约为3.3亿，心血管疾病居城乡居民总死亡原因之首，防治心血管疾病迫在眉睫。冠心病是心血管疾病中的一种，而急性心肌梗死(Acutemyocardial infarction，AMI)是冠心病发作时最主要的临床表现。心肌细胞受到损伤时，会释放蛋白类、外泌体等进入到外周血中，在不同的时间范围内达到峰值并持续一段时间。临床上一般认为这段时间为最佳检测时机，相关物质的测定结果将作为检测报告的重要依据，这些物质因此也被称为心肌标志物。心肌标志物在临床早期诊断、术前术中的实施方案以及预后治疗等各环节具有十分重要的意义。

目前，临床上诊断AMI常用的心肌标志物为心肌肌钙蛋白(cTn)，血清中cTn异常升高即可诊断为心肌损伤，但cTn水平也可能在冠状动脉疾病和非心脏疾病中上调，因此缺乏特异性，且具有时间滞后性。近年来，非编码RNA分子中的microRNA(miRNA) 已经被证实可以调节如高血压、瓣膜病、AMI等病理性的复杂过程。miRNA被证实在 AMI患者的血液中可以被检测出，同时其在血液循环中具有稳定性。其中，miR-208a 在AMI患者的血浆中1小时内可显著升高至检测水平，而在健康人群的血浆中不存在，被认为具有作为AMI生物标志物的重要潜在价值。

当前，可用于检测和定量分析miRNA的方法包括miRNA克隆、RNA印迹法、微阵列杂交、荧光定量PCR(RT-qPCR)等，但这些方法仍然有其局限性。克隆法具有识别新的miRNA的优势，但并不是一种准确的miRNA定量方法。常规RNA印迹法敏感性较差，且耗时、费力，需要大量的RNA样本和放射性探针。微阵列杂交法涉及到探针的修饰、芯片的制作及miRNA的标记等，成本较高，且设计复杂。常用的RT-qPCR 法灵敏度高、特异性强，但仪器和试剂成本均较高，且需要训练有素的操作人员，难以在基层医疗单位和现场检测中广泛使用。

因此，本领域亟需开发一种能够准确检测miRNA-208a，检测时间短、灵敏度高、不需要昂贵的设备和试剂且适于现场快速检测的方法。这对于及时诊断并救治AMI患者具有极其重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了等温扩增引物对。

本发明还要解决的技术问题是提供了等温扩增引物在制备检测miRNA-208a试剂盒中的应用。

本发明最后所要解决的技术问题是针对现有技术在检测miRNA-208a中的局限性，提供一种快速检测miRNA-208a的荧光定量试剂盒及检测方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强、重复性好、适用性广、可数字化判读的特点。