[发明专利]一种基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法

说明书

本发明公开了一种基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法，包括：(1)合成金纳米簇；(2)将核酸适配体通过氢键和静电相互作用与金纳米簇结合，得到核酸适配体与金纳米簇的复合物；(3)将核酸适配体与金纳米簇的复合物置于H₂O₂/TMB显色体系中；(4)将待测样品、核酸适配体与金纳米簇依次混合孵育并加入H₂O₂/TMB显色体系中，通过测定加入待测样品溶液与未加入待测样品溶液的H₂O₂/TMB显色体系之间的吸光度差值，建立标准曲线，定量测定样品溶液中的副溶血性弧菌含量。本发明基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力的差异，利用H₂O₂/TMB显色体系，可一步检测副溶血性弧菌，满足食源性致病菌快速高效检测的需求。

技术领域

本发明涉及致病菌检测技术领域，特别是涉及一种基于核酸适配体对靶标菌和金纳米簇亲和力差异的副溶血性弧菌一步检测方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus，V.parahaemolyticus)是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品，是常见的食源性致病菌之一。近年来因副溶血性弧菌污染引发的食物安全事件数量不断上升，因此针对副溶血性弧菌的监测和控制工作亟待加强。

传统的平板菌落计数法和生理生化鉴定方法是目前检测致病菌准确且通用的技术，但其最大弱点是耗时费力，具有明显的滞后性，无法满足快速监测预警食源性致病菌污染的需要。随着纳米技术、免疫学技术和分子生物学技术不断进步，国内外研究人员发展了电化学发光免疫传感器(ECL)、表面增强拉曼散射免疫传感器(SERS)、多重实时PCR以及环介导等温扩增技术(LAMP)等新型检测技术，实现了对致病性微生物的快速检验。这些新检测技术具有灵敏度高、特异性强、可靠性好等优点，但由于检测过程需要执行复杂的操作以及所采用的设备仪器较为昂贵，难以满足日常现场检测的需求，实际应用可行性低。比色生物传感技术以生成肉眼可见有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质颜色深度来确定待测组分的含量。与上述技术比较，比色生物传感技术操作简便、成本低廉、反应时间短、结果可视化，可以满足现场快速检测的需要，在实际应用中体现出较好的开发前景。目前比较典型的比色传感技术主要集中在两方面：一方面是基于控制金纳米颗粒的分散性和聚集性来响应靶标物质识别，例如有现有文献公开了利用高盐环境下金纳米颗粒发生团聚从而引起溶液颜色变化实现沙门氏菌和大肠杆菌的可视化检测；另一方面是基于过氧化物酶的酶促显色反应来响应靶标物质识别，如由现有文献公开了利用辣根过氧化物酶显色，成功对鼠伤寒沙门氏菌和四环素类抗生素实现了高灵敏度检测。然而，食品材料多样性决定了食品含有各种干扰成分，容易影响金纳米颗粒的分散聚集状态或者诱使生物酶变性而失活，从而影响检测结果的准确性和灵敏性。金纳米簇是由几个到几十个金原子组成的类似分子的团簇结构。由于其量子尺寸效应，金纳米簇失去传统金纳米颗粒的局部表面等离子体共振特性，而具有氧化酶和过氧化物酶催化活性。这种人工纳米酶相比生物酶性质比较稳定，可以成为生物酶的替代品。同时金纳米簇的催化活性很容易进行调节以满足实际检测的显色需求。由于纳米酶反应发生在纳米材料表面，因此表面修饰是一种有效的调控酶活性的方法，其中包括表面涂层厚度、涂层官能团类型以及表面电荷等都会改变纳米酶的催化能力。

致病菌的识别多以抗原与抗体间的免疫反应为基础，虽在灵敏度上满足了实际应用的要求，但存在选择性差的问题，且大多数抗体的保存和处理需要特定的条件以防止其变性。核酸适配体(aptamer)是一类长度在25-90bp左右的单链DNA或RNA，能以高亲和力和高选择性结合靶标物，可以作为抗体的合适替代品。与抗体相比，核酸适配体具有合成简单、价格低廉、稳定性高、对变性敏感性低、易于修饰多种功能基团等优点，因此利用核酸适配体可以有效解决实际研究应用中生物识别元件对食源性致病菌特异性识别的问题。